BRD7对过氧化氢处理的心肌细胞线粒体膜电位和胞浆中Cyt C蛋白水平影响研究

李春晓，李艳，张静静，张勇涛，杨杰书

心血管系统疾病的发病率和致死率在世界范围内位居各种疾病的首位，心血管系统是机体组织器官血液供应的基础，其可以为组织器官提供营养物质和氧气[1]。缺氧缺血、高糖、动脉粥样硬化等都会引起心血管系统氧化损伤，而心肌细胞损伤是心血管系统损伤发生的关键[2-4]。溴区包含蛋白7（bromodomain-containing protein 7，BRD7）是溴区包含蛋白家族成员，其具有高度保守性，在脑组织、结肠、心脏等组织中广泛表达，能够通过结合乙酰化的组蛋白调控基因的转录，在肿瘤发生中发挥抑制作用，能够促进细胞凋亡的发生[5,6]。近年来的研究显示，BRD7在糖尿病心肌组织中高表达[7]。线粒体是细胞凋亡发生的途径之一，细胞线粒体膜电位降低，线粒体中细胞色素C（Cyt C）释放是诱导细胞凋亡发生的重要原因[8]。本研究以探讨BRD7在过氧化氢诱导的心肌细胞氧化损伤中的作用为主要目的，为明确BRD7在心血管系统疾病中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料DMEM购自美国Hyclone；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自美国BD；BRD7抗体购自美国Santa Cruz ；胎牛血清购自美国Invitrogen；PCR所用试剂购自美国Ambion；BRD7 shRNA慢病毒和shRNA control慢病毒购自上海吉满；过氧化氢购自美国sigma；细胞线粒体膜电位检测试剂盒购自北京索莱宝；Cyt C抗体购自北京中杉金桥；IgG二抗购自美国Cell signaling。

1.2 细胞株心肌H9c2细胞购自北京北纳创联生物技术研究院，细胞在10%胎牛血清的DMEM中培养，实验所用细胞为培养至对数期的H9c2细胞。细胞瓶壁长满细胞以后，添加含有EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化，消化时间为2 min。

1.3 细胞分组处理H9c2细胞随机分成4组，正常组、对照组、阴性组、干扰组。对照组：在实验0 h时，在细胞培养液中添加过氧化氢，过氧化氢终浓度为100 μmol/L。阴性组：取感染shRNA control慢病毒的H9c2细胞，在实验0 h时，在细胞培养液中添加过氧化氢，过氧化氢终浓度为100 μmol/L。干扰组：取感染BRD7 shRNA慢病毒的H9c2细胞，在实验0 h时，在细胞培养液中添加过氧化氢，过氧化氢终浓度为100 μmol/L。正常组：以含有0 μmol/L过氧化氢的细胞培养液培养。慢病毒感染步骤如下：H9c2细胞种植到12孔细胞培养板内（每孔中加入4×104个细胞），细胞密度为40%时，在细胞中加入慢病毒颗粒，感染复数为10，12 h后进行换液。培养3 d以后，检测报告基因GFP表达情况，感染效率高于85%用于后续实验。正常组、对照组在处理12 h以后用real-time PCR和Western blot方法检测细胞中BRD7表达变化。对照组、阴性组、干扰组细胞在处理12 h以后，检测BRD7 shRNA干扰效果（real-time PCR和Western blot方法），步骤参照1.4和1.5。

1.4 Real-time PCR检测BRD7表达正常组、对照组细胞分组处理12 h以后，将上清吸除，PBS洗涤，用TRIZOL法提取总RNA，RNA溶解于RNase-free水中。反转录合成cDNA，体系为：Total RNA（2 μl）、5×PrmieScript Buffer（4 μl）、50 μm的Oligo dT primer（1 μl）、Rnase Free H2O（11 μl）、100μM的Random 6mers（1 μl）、PrmieScript RT Enzyme MIxⅠ（1 μl）。取cDNA，进行real-time PCR，real-time PCR体系为：SYBR Premix Exq Ⅱ（10 μl）、10 μm的PCR Forward Primer（0.8 μl）、RT反应液（6 μl）、50×ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（0.4 μl）、10 μM的PCR Reverse Primer（0.8 μl）、H2O（10 μl）。引物均有上海生工合成。

序列为：β-actin Forward：Forward 5’-TCA GGTCATCACTATCGGCAAT-3’，

Reverse 5，-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’。

BRD7：Forward 5’-CGTGGATCCGAAGAAG TAGAACAGACA-3’

Reverse 5，-ATTCCCGGGGAATTATTTCCTG GCTAA-3’。

1.5 Western blot检测BRD7表达正常组、对照组细胞分组处理12 h以后，在细胞中添加含PMSF的RIPA裂解溶液，冰浴30 min，离心，收集上清，分装。每个泳道30μg蛋白，上样之前同5×Loading Buffer混合煮沸变性。用10%的分离胶和5%的积层胶进行电泳，以120 V恒压电泳，观察染料到达分离胶的下端边缘，停止电泳。把蛋白凝胶取出，在4℃，100 V电压条件下将蛋白电转移到大小相同的NC膜上。用5%脱脂奶粉封闭以后，与1:600稀释BRD7抗体4℃过夜，再与1:2000稀释的IgG抗体室温孵育2 h，以ECL显色试剂盒显色，收集图像，分析各个条带的灰度值，把β-actin作为内参，分析BRD7表达变化。

1.6 MTT测定增殖活性H9c2细胞接种至96孔板（每个孔中添加2000细胞），按照上述方法分成正常组、对照组、阴性组、干扰组，在孵育12 h以后，将培养板取出，按照每个孔中加入20 μl添加MTT溶液，置于37℃结合4 h。吸除掉上清，加入120 μl的DMSO溶液，溶解结晶物以后，置于酶标仪中比色，参比波长为490 nm。

1.7 流式细胞术测定凋亡正常组、对照组、阴性组、干扰组细胞按照上述分组方法处理培养12 h以后，用含有EDTA的胰蛋白酶把细胞消化，配制成每毫升含有106个细胞的悬浮液。离心后，收集细胞沉淀，在每个细胞样品中添加100 μl的Binding buffer，将细胞悬浮以后，添加5 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，置于室温反应15 min。加入400 μl的Binding buffer，混合，置于冰上，在60 min以内进行流式细胞仪检测。

1.8 JC-1法检测线粒体膜电位正常组、对照组、阴性组、干扰组细胞按照上述分组方法处理培养12 h以后，用JC-1法检测细胞线粒体膜电位，步骤同试剂盒说明书，结果以荧光强度表示。

1.9 Western blot检测胞浆中Cyt C蛋白水平正常组、对照组、阴性组、干扰组按照上述分组方法处理培养12 h以后，用胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞胞浆蛋白，用Western blot方法检测Cyt C蛋白水平，步骤同1.5。

1.10 统计学分析实验数据均经过SPSS 21.0软件统计分析，数据用（±s）表示，两组数据用独立样本t检验，多组差异比较均用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过氧化氢刺激后心肌细胞中BRD7表达水平升高心肌细胞经过过氧化氢处理以后，细胞中的BRD7表达水平升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1、表1）。

图1 过氧化氢诱导心肌细胞中BRD7表达

表1 过氧化氢处理后心肌细胞中BRD7表达水平（±s）

表1 过氧化氢处理后心肌细胞中BRD7表达水平（±s）

注：BRD7：溴区包含蛋白7；与正常组比较，aP＜0.05

组别 正常组 对照组 P值BRD7 mRNA 1.00 3.14±0.45a 0.001 BRD7 蛋白 0.34±0.05 0.97±0.09a 0.000

2.2 BRD7 shRNA慢病毒下调心肌细胞中BRD7表达心肌细胞感染BRD7 shRNA慢病毒后，经过氧化氢处理，细胞中的BRD7表达水平降低（图2、表2）。

2.3 沉默BRD7提高过氧化氢条件下心肌细胞增殖活性过氧化氢处理以后的心肌细胞OD值降低，沉默BRD7后的心肌细胞经过过氧化氢处理以后，细胞的OD值升高（表3）。

2.4 沉默BRD7抑制过氧化氢条件下心肌细胞凋亡过氧化氢处理以后的心肌细胞凋亡率升高，沉默BRD7后的心肌细胞经过氧化氢处理以后，细胞的凋亡率降低（图3、表4）。

图2 BRD7 shRNA慢病毒感染下调过氧化氢条件下心肌细胞中BRD7的表达水平

表2 慢病毒感染后经氧化氢处理的心肌细胞中BRD7表达水平（±s）

表2 慢病毒感染后经氧化氢处理的心肌细胞中BRD7表达水平（±s）

注：BRD7：溴区包含蛋白7；与对照组比较，aP＜0.05；与阴性组比较，bP＜0.05

组别 对照组 阴性组 干扰组 P值BRD7 mRNA 1.00 1.01±0.10 0.41±0.03ab ＜0.001 BRD7 蛋白 0.90±0.10 0.92±0.08 0.38±0.06ab ＜0.001

表3 沉默BRD7对过氧化氢处理的心肌细胞OD值影响（±s）

表3 沉默BRD7对过氧化氢处理的心肌细胞OD值影响（±s）

注：OD值：吸光度值；与正常组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05；与阴性组比较，cP＜0.05

组别 OD值正常组 0.63±0.05对照组 0.32±0.03a阴性组 0.30±0.04a干扰组 0.38±0.02abc P值 0.000

图3 沉默BRD7减少过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡

表4 沉默BRD7对过氧化氢处理的心肌细胞凋亡影响（±s）

表4 沉默BRD7对过氧化氢处理的心肌细胞凋亡影响（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05；与阴性组比较，cP＜0.05

组别 凋亡率（%）正常组 3.58±0.31对照组 14.78±1.23a阴性组 14.52±1.59a干扰组 8.85±0.78abc P值 0.000

2.5 沉默BRD7提高过氧化氢条件下心肌细胞线粒体膜电位并降低胞浆中Cyt C蛋白水平过氧化氢处理以后的心肌细胞线粒体膜电位降低，胞浆中Cyt C蛋白水平升高，沉默BRD7后的心肌细胞经过过氧化氢处理以后，细胞线粒体膜电位升高，胞浆中Cyt C蛋白水平降低（图4、表5）。

图4 沉默BRD7降低过氧化氢处理的心肌细胞胞浆中Cyt C蛋白水平

3 讨论

本实验结果显示，BRD7在心肌细胞氧化损伤中高表达，沉默其表达可以减少过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡，提高心肌细胞增殖活性，这为明确BRD7在心肌细胞氧化损伤中的作用奠定了基础，在以后的实验中会在原代心肌细胞中进行验证。

氧自由基存在于正常的生命过程中，其既可以作为一种信号传递分子调控细胞的生物学特性，还可以维持细胞内氧化平衡[9]。一般情况下，机体生成的氧自由基水平同自由基清除系统处于动态平衡状态，当氧自由基的水平超过抗氧化系统的清除能力之后，机体内积累过多的氧自由基，导致氧化平衡状态被打破，引起组织细胞损伤[10]。心肌缺血、动脉粥样硬化、高血压等心血管系统疾病与氧化应激密切相关，氧化应激造成的心肌细胞损伤是心血管系统发生的重要原因[11,12]。本实验用过氧化氢处理心肌细胞，发现心肌细胞增殖活性降低，细胞凋亡率升高，说明成功构建了心肌细胞氧化应激模型。

表5 沉默BRD7对过氧化氢处理的心肌细胞胞浆中Cyt C水平及线粒体膜电位影响（±s）

表5 沉默BRD7对过氧化氢处理的心肌细胞胞浆中Cyt C水平及线粒体膜电位影响（±s）

注：Cyt C：细胞色素C；与正常组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05；与阴性组比较，cP＜0.05

组别 正常组 对照组 阴性组 干扰组 P值胞浆中Cyt C蛋白水平 0.24±0.02 0.47±0.05a 0.48±0.03a 0.32±0.04abc 0.000线粒体膜电位（荧光强度） 18.57±1.56 9.67±0.84a 9.75±1.20a 15.37±1.27abc 0.000

BRD7是在研究鼻咽癌细胞基因差别表达中筛选得到的基因，其编码的蛋白质的N端含有一个高度保守的Bromo结构域，参与蛋白与蛋白之间的相互作用，Bromo结构域可同乙酰化的组蛋白的H3区域的赖氨酸特异性结合调控染色体的重组过程[13]。另外，BRD7还是染色体重组复合物中的成员，参与DNA复制转录因子的激活，调控下游靶基因的表达，影响细胞的生物学特性[14]。有研究显示，BRD7在糖尿病心肌病大鼠心肌组织中高表达，敲除BRD7基因可以明显改善糖尿病心肌病大鼠心率和心脏重量，降低心肌组织中细胞凋亡水平[7,15]。BRD7参与细胞生长凋亡过程，在细胞增殖过程中发挥抑制作用，在细胞凋亡过程中发挥促进作用[16]。本实验的结果显示，过氧化氢诱导心肌细胞中BRD7的表达，沉默BRD7表达可以抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡，提高心肌细胞增殖活性，沉默BRD7可以发挥抗心肌细胞氧化损伤的作用。

哺乳动物线粒体在细胞凋亡中发挥重要作用，Cyt C是存在于线粒体内膜上的与细胞凋亡有关的蛋白，细胞凋亡的发生与Cyt C从线粒体内释放至胞质中有关。研究表明，线粒体跨膜电位降低是细胞凋亡发生的标志，而线粒体膜电位的维持与线粒体膜通透性转运孔的开放程度有关，正常情况下，线粒体膜电位可以调控线粒体内外物质交换，当受到DNA损伤因子、氧化应激等的刺激以后，线粒体膜通透性转运孔开放，线粒体膜电位下降，使原本存在于线粒体内的Cyt C进入到胞质中，触发凋亡级联反应。本实验的结果显示，沉默BRD7可以降低过氧化氢作用后心肌细胞胞质中Cyt C水平，升高线粒体膜电位，说明沉默BRD7可以通过线粒体途径抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡。本次实验存在一定的局限性，没有对BRD7的具体靶向调控位点进行探讨，没有在多株心肌细胞和体内进行验证，在后续实验中会对上述部分进行探索。