低浓度弹力蛋白酶不同腔内灌注压力对建立兔腹主动脉瘤模型的影响

张学慧，赵全明，聂毛晓，闫云峰，陈雪，冯婷婷，赵欣，张明多

腹主动脉瘤（AAA）是指腹主动脉局部永久性扩张，直径大于正常腹主动脉内径的50%。它是一种较为常见而严重的心血管疾病[1]。AAA病变位于基质丰富的主动脉中膜，以弹力纤维断裂伴随巨噬细胞浸润为特征，随着主动脉中膜弹力纤维的断裂，主动脉内腔逐渐扩张，当动脉瘤壁承受的应力超过其自身强度时就会发生破裂，其结果是致命性的，死亡率达90%[2-8]。

AAA的发病原因和机制尚不完全清楚，其模型的制作对于研究其进展机制有重要的临床意义。目前较常用的AAA动物模型的建立方法主要包括：直接手术干预腹主动脉形成的AAA动物模型。包括：肾下腹主动脉间异体静脉或人工血管形成的AAA动物模型，肾下腹主动脉前壁补片形成的AAA动物模型和用气囊扩张肾下腹主动脉建立的AAA动物模型三种。根据AAA发病机制诱导而成的AAA动物模型。包括：弹力蛋白酶肾下腹主动脉加压灌注建立的AAA动物模型：遗传缺陷诱导出的AAA动物模型两种。

腹主动脉弹力蛋白酶加压灌注制备的AAA模型与人体腹主动脉瘤有相似的病理特点，其机制是通过加压灌注弹力蛋白酶诱导腹主动脉损伤，引起腹主动脉炎症反应，动脉壁结构破坏最终导致AAA形成[3-10]。然而不同文献显示，在制作AAA动物模型的过程中，弹力蛋白酶腔内灌注压0～400 mmHg不等 ，模型制作的成功率存在较大的差异。本实验采用低浓度弹力蛋白酶腔内灌注，分组讨论不同腔内灌注压力对兔AAA模型成瘤率及死亡率的影响，筛选出制造兔AAA模型的最适宜腔内灌注压力[2-5,9,11]。

1 材料与方法

1.1 材料健康雄性新西兰大白兔30只（北京芳元缘养殖场，许可证号：SCXK（京）2014-0012），体重2.5～3 kg。猪胰弹力蛋白酶（45124，美国Sigma-aldrich公司产品），戊巴比妥钠（Bioszune公司，USA），肝素钠注射液（北京双鹤药业有限公司），0.9%氯化钠（山东华鲁制药有限公司）。4F Forgaty双腔球囊导管（北京生命绿洲科技有限责任公司）。HE染色、EVG染色及Masson染色试剂盒（武汉谷歌生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组健康雄性新西兰大白兔30只，随机分为A、B、C三组，每组各10只，每组腹主动脉腔内灌注10 μl浓度为50 u/ml，PH=9的弹力蛋白酶溶液，灌注保持时间为7～10 min，腔内灌注压力为A组0 mmHg，B组 100～200 mmHg，C组300～400 mmHg。

1.2.2 建立兔腹主动脉瘤模型①准备：所有实验动物术前禁食10 h以上，禁水4 h，术前30 min，静脉注射肝素钠（125 U/kg）抗凝，腹腔注射3%戊巴比妥钠（1～1.5 ml/kg）麻醉。兔台固定，去毛，消毒铺巾，严格无菌操作。②游离股动脉：左侧股总动脉处切口，分离并游离股总动脉约0.5～1 cm，分别于近心端、远心端穿线备用。③腹腔手术：沿腹中线打开腹腔，显露并游离一段动脉分支少的肾下腹主动脉，近心端、远心端分别放置橡胶滤线并缠绕两圈备用。④股动脉穿刺放置导管：结扎股动脉远心端，动脉夹阻断近心端。将股动脉切一小口，送入微导管。松开股动脉近心端，将微导管轻柔地送入游离出的主动脉段内，将腹主动脉近心端、远心端的橡胶滤线提紧，近心端用动脉夹夹闭，形成与微导管相通的封闭的动脉囊腔。⑤抽尽腔内血液，用肝素生理盐水经微导管冲洗动脉囊腔3次。将10 μl浓度为100 u/ml、PH=9的弹力蛋白酶溶液注入动脉腔内。⑥根据分组设计，用加压泵对各组动脉进行不同的加压控制，保持每组灌注时间为7～10 min。⑦抽出胰蛋白酶，肝素生理盐水冲洗管腔，恢复动脉血流，去除滤线，拔出导管，结扎股动脉近心端，缝合关腹。⑧术后青霉素注射3 d。

1.2.3 腹主动脉超声测量各组动物于术前及术后第7 d行腹主动脉超声检查，取长轴切面和横切面图像，经超声仪器后处理软件测量管腔直径，将横切面（前后径或左右经）最大径作为动脉瘤直径，计算腹主动脉扩张率。扩张率=（腹主动脉瘤内径-腹主动脉平均内径）/腹主动脉平均内径；腹主动脉平均内经=（瘤上端内径+瘤下端内经）/2。

1.2.4 获取标本及检测超声检测之后，再次开腹解剖，小心暴露动物心脏与髂总动脉分叉之间的胸腹主动脉，清除附着于动脉上的脂肪与组织（留右肾动脉作标记），取出灌注动脉段，进行4 μm切片，应用HE染色、EVG染色和马松染色（Elastic-Masson）分析组织结构和中膜弹力纤维。

1.3 统计学分析采用SPSS 24.0进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示。组间比较，若方差齐，则采用两独立样本t检验；若方差不齐，则采用两独立样本校正t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对比三组腹主动脉瘤模型建立结果三组家兔灌注前腹主动脉平均直径是2.5 mm。A组存活10只，灌注部位血管扩张率为（16±9.4）%，成瘤率为0%，存活率为100%；B组存活10只，灌注部位血管扩张率为（98.8±16.4）%，成瘤率100%，存活率为100%；C组存活4只，存活动物灌注部位血管扩张率为（110±13.3）%，成瘤率100%，存活率为40%。

2.2 超声检测腹主动脉直径变化分别与B、C组比较，A组术后瘤体最大直径小于B、C组，差异有统计学意义（P＜0.05）。比较B、C组两组术后瘤体最大直径，差异无统计学差异（P＞0.05）。B、C组扩张率、成瘤率高于A组，A、B组成活率高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1、图1）。

2.3 肉眼观察通过对兔腹主动脉标本的解剖收集，观察到A组无一成瘤，而B、C两组可以看到灌注血管段明显膨隆。

表1 超声检测腹主动脉直径变化（±s）

表1 超声检测腹主动脉直径变化（±s）

组别 瘤体最大直径（mm）成活率（%）A组 2.9±0.24 16.0±9.4 0 100 B组 4.97±0.41 98.8±16.4 100 100 C组 5.25±0.33 110.0±13.3 100 40扩张率（%）成瘤率（%）

图1 各组超声检测中纵切面与横切面图像

2.4 病理组织学结果A组HE染色示动脉壁结构清晰，细胞排列整齐，无明显的炎症细胞浸润；EVG染色示管壁结构正常，弹力纤维结构完整连续，保持原有曲度。Masson染色示管壁结构正常，未见明显的胶原纤维增多，弹力纤维及平滑肌细胞未见明显减少。B、C组HE染色示动脉壁结构破坏，并可见明显的炎症细胞浸润；EVG染色示中膜弹力纤维严重受损，层次不清，部分断裂、降解，失去原有的曲度及连续性。Masson染色示中膜层结构破坏，层次紊乱，外膜层增厚胶原纤维组织增多，弹力纤维及平滑肌细胞减少，见图2。

3 讨论

图2 各组HE染色、EVG染色与Masson染色图像

腹主动脉瘤是一种无声的威胁生命的退行性疾病，它的发病机制复杂尚不完全清楚[3]。AAA动物模型的建立对于研究其发病机理、评估药物治疗的有效性至关重要。Anidjar等于20世纪90年代首先创立了弹力蛋白酶灌注法建立AAA模型的方法，其机制是通过腹主动脉腔内灌注弹力蛋白酶，诱导大鼠腹主动脉损伤，从而引起腹主动脉炎症反应，导致动脉壁结构破坏，最终形成AAA。其机制因与人体腹主动脉瘤的形成有相似的病理特点因而被广泛采用[12]。弹力蛋白酶血管腔内加压灌注是目前建立AAA模型普遍实施的方法，研究表明弹力蛋白酶灌注过程中给予一定的灌注压力，可以增加腹主动脉管腔内压力，在一定程度上破坏内皮细胞间的紧密连接，从而增强弹力蛋白酶对血管壁的作用[3,4,12-14]。

Matsushita等采用此法成功制备了兔AAA模型，但在模型制备过程中灌注动脉段的峰值压力达到300～400 mmHg[15]。有研究表明AAA模型制作过程中，给予过高的灌注压，容易引起弹力蛋白酶经血管壁微循环进入血液，有诱发急性胰腺炎及其他组织损伤的可能，而且管腔内压力过高也容易造成弹力蛋白酶外渗至管腔外，造成管腔破裂动物大出血死亡。本研究中A组成瘤率为0表明AAA模型制备过程中需要一定的压力，破坏动脉内膜，使弹性蛋白酶渗透进血管内皮细胞进而发挥作用[10]。本研究结果表明在灌注酶浓度和灌注时间相同的情况下，灌注压力100～200 mmHg组兔成瘤率最高、死亡率最低，是弹力蛋白酶血管腔内加压灌注制备AAA模型最理想的灌注压力。

有学者采用弹力蛋白酶加压灌注法成功制备兔AAA模型，但其弹力蛋白酶灌注保持时间高达30 min[16]。Matsushita等研究报道显示家兔对脊髓局部缺血非常敏感，肾下腹主动脉结扎20 min，即可引起71%的实验兔截瘫，结扎1 h，可引起所有的实验兔脊髓梗死[7]。马巍等研究显示开腹后结扎腹主动脉25 min左右即可引起家兔脊髓缺血。Zhao等研究表明，使用一定浓度的弹力蛋白酶，在相对较短的灌注时间（7～10 min）内即可制备兔AAA模型，并可减少动脉缺血时间及脊髓缺血并发症[17]。

本文结果证实经腹主动脉腔内灌注低浓度弹力蛋白酶（50 u/ml），将灌注压保持在100～200 mmHg，能够在较短时间内成功制备腹主动脉瘤模型，且成瘤率高、死亡率低。