广东地区汉族人群乙醛脱氢酶2基因Glu504Lys多态性的研究

王 慧，罗 娥，欧雅文

(1.广州医科大学附属第一医院检验科，广州 510120；2.广州医科大学，广州 510180)

乙醛脱氢酶(ALDH)和乙醇脱氢酶(ADH)在人体内共同组成了人乙醇脱氢酶系，负责催化人体的乙醇分解代谢。其中，ALDH主要有两种，即对乙醛亲和力较弱的胞质同工酶(ALDHl)和亲和力较强的线粒体同工酶(ALDH2)。 ALDH2在肝和胃中具有很高的表达量，是乙醇代谢途径中最重要的酶之一，若编码该酶的基因异常将会导致乙醛代谢受阻，在体内堆积，造成机体损伤。ALDH2基因具有高度的多态性，其中以东方人缺失的发生率最高[1]。ALDH2基因位于12号染色体，由13个外显子构成，由于第12个外显子内存在一个单核苷酸多态(SNPs) rs671，出现碱基置换：当鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)时，导致该基因编码蛋白504位的谷氨酸(Glu)替换为赖氨酸，即Glu504Lys，使得酶活性大大下降[2]。所以，ALDH2有两个等位基因：野生型(ALDH2*1，*504Glu)，突变型(ALDH2*2，*504Lys)。人群中该酶基因型存在3种组合方式：野生纯合型ALDH2*1/*1(Glu504Glu)，产生具有正常催化活性的酶；突变杂合型ALDH2*1/*2(Glu504Lys)，产生的酶催化活性下降；突变纯合型ALDH2*2/*2(Lys504 Lys)，产生的酶催化活性明显降低。本研究将检测ALDH2基因多态性在广东地区汉族人群中的分布，并与其他地区的分布情况进行比较。

1 资料与方法

1.1一般资料 在广州医科大学附属第一医院进行健康体检或住院的广东地区成年汉族人共296例，其中男192例，年龄28～85岁；女104例，年龄35～81岁。

1.2仪器与试剂 ABI9700 PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)，e-Hyb全自动杂交仪和BE-2.0生物芯片适读仪(上海百傲科技有限公司)，Thermo NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)。血液基因组DNA提取纯化试剂盒和ALDH2基因检测试剂盒，购自上海百傲科技有限公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取 抽取受检者静脉血2 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中抗凝，按照血液基因组DNA提取纯化试剂盒的流程提取血液基因组DNA；用超微紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，DNA水平应在10～60 ng/μL为宜，OD260/OD280的比值应为1.5～2.0。

1.3.2聚合酶链式反应(PCR)扩增 ALDH2扩增液融解后，将其分装到0.2 mL离心管中，每管22 μL，在各扩增管中分别加入1 μL反应液A，在各扩增管中分别加入2 μL提取好的样品基因组DNA，总反应体系为25 μL；将各离心管放入PCR仪中，按下列条件进行扩增：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。

1.3.3芯片杂交显色 按操作说明配好预杂交液、杂交反应液(190 μL杂交缓冲液+10 μL ALDH2扩增产物)、洗液1、洗液2、洗液3、抗体液和显色液；在百傲e-Hyb全自动杂交仪上选择已设置好的杂交程序，将ALDH2基因芯片放入芯片片架中，并插入到杂交仪插片口内，将配好的杂交反应试剂条正确放入杂交仪中相应位置，运行杂交程序。

1.3.4芯片识读与数据分析 启动BE-2.0生物芯片适读仪，将芯片放入适读仪中，运行基因芯片图像分析软件进行图像扫描与分析，图像分析自动输出检测报告。每次实验设置阴性对照(空白)，阳性对照(ALDH2*2/*2)，跟随标本一起进行试验，以保证结果的准确性。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据处理及统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1ALDH2基因型 研究标本检测出的ALDH2基因型共有3种，分别为GG型(野生纯合子)ALDH2*1/*1(Glu504Glu)；GA型(突变杂合子)ALDH2*1/*2(Glu504Lys)；AA型(突变纯合子)ALDH2*2/*2(Lys504Lys)，见图1。

注：A为ALDH2*1/*1(Glu504Glu)；B为ALDH2*1/*2(Glu504Lys)； C为ALDH2*2/*2(Lys504Lys)

图1 ALDH2基因型3种扫描结果

2.2研究人群ALDH2基因型及等位基因分布频率 ALDH2各基因型及等位基因分布情况见表1。各基因型(GG型、GA型、AA型)在不同性别广东地区汉族人群中差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 ALDH2基因多态性的分布

2.3研究人群ALDH2基因多态性分布的比较 进一步将ALDH2的各基因型分成ALDH2野生型组(GG)及ALDH2突变型组(GA+AA)；将ALDH2的各基因型分成ALDH2(AA)组及ALDH2(GG+GA)组。分组结果均显示，不同性别组组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4广东地区汉族人群ALDH2基因型和等位基因频率结果 广东地区汉族人群ALDH2*1/*1、ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2 3种基因型的频率分别为54.7%(162/296)、 37.5%(111/296)、7.8%(23/296)；广东地区汉族人群ALDH2*1及ALDH2*2等位基因频率分别为73.5%、26.5%；广东地区汉族人群突变型基因(ALDH2*1/*2+ALDH2*2/*2)的频率为45.3%。

表2 ALDH2基因多态性分布的比较[n(%)]

3 讨 论

乙醇进入体内后，将通过以下途径代谢：乙醇→乙醛→水、二氧化碳→排出体外。乙醛在体内的清除快慢是由“酒精基因”ALDH2决定的。当ALDH2基因发生突变，将使ALDH活性降低，使乙醇在体内从乙醇→乙醛→水、二氧化碳的代谢过程受阻，大量乙醛滞留在体内，将会增加醉酒的严重性和导致身体伤害。YAMAMOTO等[3]的研究结果表明，饮酒后ALDH2纯合子缺失者(ALDH2*2/*2)血液中的乙醛水平是携带ALDH2野生纯合子者(ALDH2*1/*1)的19倍，是ALDH2突变杂合子者(ALDH2*1/*2)的3倍。这说明ALDH2 等位基因缺损者，无论是赖氨酸纯合型，还是谷氨酸赖氨酸杂合型，ALDH2 都不具有活性或活性很低。因此，ALDH2基因发生突变的人，不能快速地完成酒精代谢过程，导致乙醛在体内堆积，将对人体的肝、肾、心、脑造成严重伤害，检测ALDH2基因多态性在筛选乙醇不耐受人群，并采取有效的保护和干预措施等方面都具有潜在的应用前景。

硝酸甘油是心绞痛急性发作的常规首选药物，但该药的临床疗效常因人而异，中国汉族人群中，硝酸甘油含服无效的比例高达25%以上[4]。硝酸甘油需先在体内经ALDH2生物转化，然后才能释放出有药理活性的一氧化氮，发挥其抗心绞痛作用。如果患者基因中携带有ALDH2突变，会导致硝酸酯酶活性降低，从而使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此，今后医生在临床使用硝酸甘油的过程中，需考虑患者的这一遗传因素，用药前必须考虑先检测患者的ALDH2基因型，以减少用药无效导致的意外死亡。

大量文献均显示ALDH2基因型与心血管疾病、癌症和药物代谢等均存在很大的关联性[5-7]，ALDH2基因突变人群罹患结直肠癌、食管癌、胃癌、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌梗死等疾病风险更高。而我国汉族人群ALDH2的基因型存在普遍的变异性，因此在人群中进行ALDH2基因型的普查,对该类人群无论从某些药物的应用上，还是在心血管病防治及癌症等疾病的研究中都有重要的启示性。

检测基因多态性的方法很多，包括荧光定量PCR技术、测序技术、等位基因特异性PCR技术、PCR-限制性片段长度多态性技术等。本研究采用的是DNA微阵列芯片法：提取样品基因组DNA后，用ALDH2基因特异引物进行PCR扩增；将带生物素标记的扩增产物与固定在醛基基片上的ALDH2基因型检测探针进行特异杂交反应，并通过酶促显色反应，使特异性杂交信号出现颜色；通过对芯片进行扫描，得到样品DNA与ALDH2(Glu504Lys)基因位点的野生型和突变型探针杂交形成的杂交图像，判断待检样品的基因型。该方法操作简单，一张芯片即可检测一个样本，可自动化检测和分析，结果准确可靠，通过一次检测即可获得患者的相关遗传信息，终生受用，可用于指导制定合理用药方案，实现个性化治疗。

ALDH2第12外显子的基因多态性存在明显的种族差异，亚洲人群中，ALDH2*1/*2 基因型频率为30%～50%[1]。但是同一种族不同地域的人群ALDH2基因多态性分布也不一致，本研究显示广东地区汉族人群ALDH2*1/*1、ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2 3种基因型的频率分别为54.7%、37.5%、7.8%。据国内研究报道，上海人群3种基因型的频率分别为65.4%、29.8%、4.8%；山东人群3种基因型的频率分别为72.1%、26.3%、1.6%；湖北人群3种基因型的频率分别为78.1%、21.9%、0%；浙江人群3种基因型的频率分别为55.55%、38.90%、5.55%[8-10]。

广东地区汉族人群ALDH2*2等位基因频率为26.5%，上海汉族人群ALDH2*2等位基因频率为19.7%，山东地区人群为14.7%，湖北地区人群为10.9%，浙江地区人群为25.0%，即广东地区汉族人群ALDH2*2等位基因频率高于以上各地区。提示广东地区人群对乙醛的代谢能力差，对乙醇的耐受性差。

本研究结果显示广东地区汉族人群突变型基因(ALDH2*1/*2+ALDH2*2/*2)的频率为45.3%，说明广东地区汉族人发生ALDH2基因突变的概率较高，高于文献[8-10]报道的上海(34.6%)、山东(27.9%)、湖北(21.9%)等地区，即广东地区人群中ALDH及硝酸酯酶活性降低的概率高，从而导致对乙醛的代谢能力差，对乙醇的耐受性低，对硝酸甘油的无效概率高；此人群中ALDH2 酶活性缺乏者占近半数，罹患相关疾病的风险值可能会升高。

因此，在广东人群中进行ALDH2基因的普查检测非常重要，可为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的预防提供有效的参考依据。