外源喷施水杨酸对冬瓜枯萎病的防治效果及机制

李红杰

(内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头 014109)

冬瓜(BenincasahispidaCogn.)属葫芦科冬瓜属一年生植物，原产于我国南部和印度，富含多种人体所必需的矿质元素和维生素，深受人们的喜爱，在我国已有2 000多年的栽培历史[1-3]。近年来，随着种植面积的不断扩大和连作年限的延长，冬瓜病害问题日益频发，尤其是冬瓜枯萎病的发生逐年加重，已成为我国冬瓜产业发展的主要障碍因素之一[4]。冬瓜枯萎病是一种由尖刀镰孢菌冬瓜专化型(FusariumoxysporumSchl. f.sp.benincasae)引起的土传性真菌病害，可在冬瓜整个生育期内进行危害，轻则造成减产，重则导致绝收，给农户带来巨大的经济损失[5]。目前，前人在种质资源抗性评价[6]、抗性遗传规律[7]、分子标记[8]及化学药剂防治[9]等方面对冬瓜枯萎病展开了相应的研究，但是高抗枯萎病的冬瓜品种鲜见有相关报道，而化学药剂的防治效果也不甚理想。因此，高效的生物防治药剂开发已成为冬瓜生产中亟须解决的关键问题。水杨酸是植物体内的一类小分子酚类物质，具有植物内源信号分子功能，与植物的抗病性密切相关[10]。王铮等研究表明，外源喷施水杨酸可诱导烟草对斑萎病、花叶病、野火病及赤星病等产生抗性，可显著减少农药的使用量[11]；薛仁风等研究表明，水杨酸处理可诱导普通菜豆的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，简称PAL)活性、过氧化物酶活性、过氧化氢含量明显升高，从而显著提升普通菜豆对枯萎病的抗性[12]；石亚莉等研究表明，外源喷施水杨酸可显著提升采后苹果果肉组织的保护酶及病程相关蛋白活性，酚类及类黄酮物质明显积累，从而提高了采后苹果对灰霉病的抗性[13]。然而，关于水杨酸对冬瓜枯萎病的影响尚未见相关报道。因此，本研究以铁柱999冬瓜品种为研究对象，研究外源喷施水杨酸对冬瓜枯萎病抗病性及相关生理生化指标变化的影响，初步探讨水杨酸对冬瓜枯萎病的抗性诱导机制，以期为水杨酸在冬瓜枯萎病防治方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试冬瓜品种为铁柱999，购自湖南省长沙市银田蔬菜种子实业有限公司；供试冬瓜枯萎病病原菌尖刀镰孢菌(FusariumoxysporumSchl.)由笔者所在实验室自主分离、保存；供试水杨酸为分析纯水杨酸，购自生工生物(上海)股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 2017年3月20日在内蒙古农业大学职业技术学院日光温室内穴盘育苗。4月5日选取长势一致的铁柱999冬瓜幼苗150株，分别定植于40 cm×50 cm 的花盆中，栽培土壤为当地日光温室普通土壤，每盆定植1株。试验共设置5个处理，即在定植后分别用浓度为50、100、150、200 mg/L 的水杨酸溶液进行叶面喷施，每天喷施1次，10 mL/次，连续喷施3次，以喷施等量的无菌清水作为对照(CK)，每个处理10株，重复3次，共计150株。水杨酸连续3次喷施完成后，每株接种2.0×106CFU/g土的尖镰孢菌。整个试验期间，给予各植株正常的水肥管理。

1.2.2 项目测定及方法 冬瓜枯萎病发病情况于接种后5 d开始调查，每隔3 d调查1次，共调查6次，病情指数及防治效果计算按照赵仕光等的方法[14]进行。生理生化指标于接种前进行第1次测定，第2次于接种后5 d进行测定，之后每隔3 d测定1次，共测定6次。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)活性、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，简称PPO)活性、过氧化氢酶(catalase，简称CAT)活性及PAL活性测定分别采用抑制硝基四氮唑(NBT)光还原比色法、三氯乙酸比色法、紫外分光光度法和苯丙氨酸比色法进行；几丁质酶(chitinase，简称CHT)活性测定采用徐恩静等的方法[15]；β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-glucan，简称GLU)活性测定采用蒋选利等的方法[16]；H2O2含量测定采用高锰酸钾法；丙二醛(malonic dialdehyde，简称MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.2.3 数据分析 试验数据的整理、计算及作图采用Excel 2007软件进行，用SPSS 18.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 外源喷施水杨酸对冬瓜枯萎病的影响

由图1-a可知，在整个试验期间，5种处理的冬瓜枯萎病病情指数均随着时间的延长而逐渐升高。喷施相同时间时，150 mg/L外源水杨酸喷施处理的冬瓜病情指数始终最低，CK始终最高。在接种后20 d时，CK、50、100、150、200 mg/L 处理的病情指数分别达到62.15、42.05、35.18、28.25、31.33。假设CK对冬瓜枯萎病的防治效果为0，则4种不同浓度外源水杨酸喷施处理的防治效果依次为52.15%、60.16%、78.02%、67.78%。由图1-b可知，150 mg/L 处理与50 mg/L处理达到极显著差异水平(P<0.01)，与100 mg/L处理达到显著差异水平(P<0.05)。上述结果表明，外源喷施水杨酸可明显降低冬瓜枯萎病病情指数，提升枯萎病防治效果，其中以浓度 150 mg/L 喷施效果最佳。

2.2 外源喷施水杨酸对冬瓜叶片SOD、PPO、CAT及PAL活性的影响

由图2可见，在接种枯萎病病原菌后，5种处理下的冬瓜叶片SOD、PPO及PAL活性均随着时间的延长而表现为先升高后降低的趋势。在整个试验期间，150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的SOD、PPO及PAL活性在同一时间点始终保持最高，并在接种后17 d活性达到最高，此时SOD活性分别较CK、50、100、200 mg/L处理提升82.33%、16.6%、10.25%、4.07%，PPO活性分别较CK、50、100、200 mg/L提升 73.22%、26.08%、15.07%、3.82%，PAL活性分别较CK、50、100、200 mg/L提升176.61%、28.06%、18.14%、6.03%，与CK及50 mg/L处理差异达到极显著水平(P<0.01)，与 100 mg/L 处理差异达到显著水平(P<0.05)。CAT活性在外源喷施水杨酸处理下表现为先降低后升高的趋势，在整个试验期间，150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的CAT活性始终保持最低，并在接种后17 d达到最低，分别较CK、50、100、200 mg/L处理降低34.42%、25.96%、17.72%、8.98%，与CK及50 mg/L处理差异达到极显著水平(P<0.01)，与 100 mg/L 处理差异达到显著水平(P<0.05)。上述结果表明，外源喷施水杨酸可提升冬瓜叶片的SOD、PPO及PAL活性，降低CAT活性，以浓度150 mg/L处理效果最佳。

2.3 外源喷施水杨酸对冬瓜叶片CHT及GLU活性的影响

CHT和GLU是2个非常重要的病程相关蛋白，在植物抗病防御体系中发挥着非常重要的作用[17]。CHT属于水解酶类，主要通过水解真菌菌丝合成的几丁质抑制病原菌生长[17]。外源喷施水杨酸对冬瓜叶片CHT活性的影响如图 3-a 所示，外源喷施水杨酸可明显提升冬瓜叶片的CHT活性，且CHT活性随着时间的延长表现为先升高后降低的趋势。在整个试验期间，150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的CHT活性始终保持最高，并在接种后17 d达到最高，分别较CK、50、100、200 mg/L提升93.75%、14.72%、9.11%、4.75%，与CK及50 mg/L处理差异达到极显著水平(P<0.01)，与 100 mg/L 处理差异达到显著水平(P<0.05)。

GLU属糖基水解酶类，不仅可以通过水解真菌细胞壁的主要成分β-1，3-葡聚糖而抑制真菌生长，而且可以间接诱导植物体内植保素的积累，从而提高植物抗病性[17]。由图 3-b 可见，外源喷施水杨酸可提升冬瓜叶片的GLU活性，同时，GLU活性随时间延长呈现先升高后降低的趋势。150 mg/L 外源水杨酸喷施处理下的GLU活性在整个试验期间始终保持最高，并在接种后17 d达到最高，分别较CK、50、100、200 mg/L提升254.57%、65.36%、47.62%、5.92%，与CK及50 mg/L处理差异达到极显著水平(P<0.01)，与 100 mg/L 处理差异达到显著水平(P<0.05)。上述结果表明，外源喷施水杨酸可提升冬瓜叶片的CHT及GLU活性，以浓度 150 mg/L 处理效果最佳。

2.4 外源喷施水杨酸对冬瓜叶片H2O2及MDA含量的影响

H2O2不仅是植物体内的活性氧，同时更是抗病反应中的重要信号分子，在植物抗病反应中发挥着重要作用[18]。由图4-a可知，外源喷施水杨酸可促进H2O2在冬瓜叶片中的积累。在接种枯萎病病原菌后，5种处理下的冬瓜叶片中H2O2含量随着时间的延长均表现为先升高后降低的趋势。在整个试验期间，150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的H2O2含量始终保持最高，并在接种后17 d含量达到最高，分别较CK、50、100、200 mg/L提升44.08%、15.27%、10.11%、2.82%，与CK及50 mg/L处理差异达到极显著水平(P<0.01)，与 100 mg/L 处理差异达到显著水平(P<0.05)。说明，外源喷施水杨酸可促进H2O2在冬瓜叶片中的积累，以浓度 150 mg/L 喷施时H2O2含量最高。

MDA含量是衡量膜质过氧化程度的重要指标[19]。由图4-b可见，外源喷施水杨酸可降低冬瓜叶片的MDA含量，且MDA含量随时间的延长表现为逐渐增加的趋势。150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的MDA含量在整个试验期间始终保持最低，在接种后20 d达到最高，MDA含量分别较CK、50、100、200 mg/L 降低37.3%、20.14%、13.24%、6.53%，与CK及50 mg/L处理差异达到极显著水平(P<0.01)，与100 mg/L处理差异达到显著水平(P<0.05)。上述结果表明，外源喷施水杨酸可降低冬瓜叶片中的MDA含量，以浓度150 mg/L喷施MDA含量最低，膜脂过氧化程度最轻。

3 结论与讨论

水杨酸作为植物重要的内源信号分子，在植物抗病体系中发挥着重要的作用[10]。本研究结果表明，外源喷施水杨酸可降低冬瓜枯萎病病情指数，提升冬瓜枯萎病防治效果，且效果因喷施浓度大小而异， 以浓度150 mg/L喷施效果最佳， 冬瓜枯萎病防治效果达到78.02%。本研究结果与王铮等在烟草方面[11]、薛仁风等在普通菜豆方面[12]及石亚莉等在采后苹果方面[13]的研究结果较为一致，可能是由于外源喷施水杨酸可提升植物的防御酶及病程相关蛋白酶活性，进而诱导植物产生抗病性。

植物自身拥有一套完整的防御酶系统，以抵御生物和非生物逆境对自身造成的伤害[18]。本研究结果表明，外源喷施水杨酸可提升冬瓜叶片的SOD、PPO及PAL活性，降低CAT活性。以浓度150 mg/L处理效果最优，接种后17 d冬瓜叶片的SOD、PPO及PAL活性分别较CK提升82.33%、73.22%、176.61%，CAT活性较CK降低34.42%，均达到极显著差异水平(P<0.01)；本研究结果与王铮等在烟草方面[11]、薛仁风等在普通菜豆方面[12]及石亚莉等在采后苹果方面[13]的研究结果较为一致。

CHT和GLU是2个非常重要的病程相关蛋白，在植物抗病防御体系中发挥着重要的作用[17]。本研究结果表明，外源喷施水杨酸可提升冬瓜叶片的CHT和GLU活性。在整个试验期间，150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的CHT及GLU活性始终保持最高，接种后17 d冬瓜叶片的CHT及GLU活性分别较CK提升93.75%、254.57%，均达到极显著差异水平(P<0.01)，本研究结果与石亚莉等在采后苹果方面的研究结果[13]较为一致。

H2O2是植物抗病反应中的重要信号分子，与植物抗病性密切相关[19-20]。本研究结果表明，外源喷施水杨酸可促进H2O2在冬瓜叶片中的积累。在整个试验期间，150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的H2O2含量始终保持最高，并在接种后17 d含量达到最高，较CK提升44.08%，达到极显著差异水平(P<0.01)，本研究结果与苑智华在东方百合方面[21]、薛仁风等在普通菜豆方面[12]及马玄等在杏方面[20]的研究结果较为一致，其原因可能是CAT是分解过氧化氢的关键酶，而外源喷施水杨酸可显著降低植物的CAT活性，进而导致过氧化氢在植物体内积累，提高抗病性。

MDA含量是衡量膜脂过氧化程度的重要指标[19]。本研究结果表明，外源喷施水杨酸可降低冬瓜叶片的MDA含量，150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的MDA含量在整个试验期间始终保持最低，在接种后20 d MDA含量达到最高，较CK降低37.3%，达到极显著差异水平(P<0.01)，其原因可能是150 mg/L外源水杨酸喷施处理下的冬瓜叶片防御酶活性最高，因此膜脂过氧化程度最轻，MDA含量最低。

综上所述，外源喷施水杨酸可提升冬瓜对枯萎病的防治效果，以浓度150 mg/L处理效果最佳，其机制可能是外源喷施水杨酸可诱导冬瓜叶片的防御酶活性(SOD、PPO、PAL)和病程相关蛋白酶活性(CHT、GLU)上升，CAT活性降低，进而导致H2O2积累和膜脂过氧化程度降低，从而提升冬瓜枯萎病抗性。