玉米种质对丝黑穗病的抗性分析及发病条件研究

郭 成， 赵瑞丽， 王春明， 张有富， 周天旺， 郭满库， 段灿星

(1. 甘肃省农业科学院植物保护研究所， 甘肃 兰州730070； 2. 农业部天水作物有害生物科学观测实验站， 甘肃 天水741200；3. 甘肃农业大学植物保护学院， 甘肃 兰州730070； 4. 河西学院农业与生物技术学院， 甘肃 张掖734000；5. 中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程， 北京100081)

玉米(Zeamays)是禾本科(Poaceae)一年生粮食、饲料、油料和工业原料作物，在国民经济和农业生产中占有重要的地位[1-3]。2017年中国玉米种植面积和总产量均居农作物之首，分别为3 544.5万hm2和21 589.1万t，较2016年减产1.7%[4]。因此，玉米的生产稳定性直接影响到我国粮食作物的生产安全和延伸产业的发展[5]。病虫害是制约玉米高产稳产的重要因素，我国每年因病虫害发生和流行而导致玉米产量损失约1 000万t[6]。

玉米丝黑穗病是世界玉米产区普遍发生的病害，由孢堆黑粉菌(Sporisoriumreilianum)引起，是一种对玉米生产造成极大危害的土传真菌病害[7]。近年来，随着感病品种或制种亲本的连年种植、秸秆还田后造成病菌大量累积，如沈试系列、沈单系列、掖单51、掖单13、登海1号、白单31等品种和以黄早四及其改良系为代表的亲本自交系，致使玉米丝黑穗病又开始回升蔓延并呈加重趋势[8]。2017年本课题在甘肃省平凉市崆峒区甘肃农业大学试验站调查发现，部分杂交种发病率高达65.2%，但不同玉米品种对丝黑穗病的抗性不同，品种间差异明显。

玉米作为青贮饲料，对草食畜牧业的发展，起着举足轻重的作用[9]。青贮玉米感染丝黑穗病后不仅会影响产量，还会影响饲料质量，牲畜食用后会导致健康问题[10]。选育和种植抗病品种是防止玉米丝黑穗病发生流行和稳产增收的重要措施，鉴定和评价玉米品种及育种亲本的抗病性则是抗病育种的重要环节[11]。许多学者经过大量研究，筛选出了一批高抗自交系[12-18]，如KH13、FR218、D2374、T432、育系243、育系254、育系490、育系541、吉T5、吉63/o2、吉846、吉992、赤L5、赤L155、粤48、粤57-1、酒341-2、鲁原92、郑653、沙1、宁45、晋穗54等。但具备突出抗丝黑穗病特性的优异种质资源仍然缺乏，因此，广泛发掘在未来育种中可以利用的丝黑穗病抗源仍是玉米资源鉴定的重要工作之一。

玉米丝黑穗病发病率等于损失率的产量损失特点，对玉米产业的为害尤为严重，因此，控制该病害的发生和为害具有极其重要的意义。抗病品种的有效利用不仅降低了病害发生率和产量损失，也是国家重点研发计划“双减项目”中减药的重要举措之一。因此，种植和利用抗病品种是控制病害最安全和高效的措施，而优异的抗性种质是进行抗病品种选育和种质改良的前提和基础。因此，本研究在2012—2015年间对国家玉米种质资源库中1164份玉米种质进行了丝黑穗病抗性鉴定和评价，拟为玉米抗丝黑穗病育种提供核心抗源和技术支持。同时通过田间不同播期和接菌量试验，对丝黑穗病的发病温度和菌源量进行了分析，以期明确丝黑穗病发病的最佳发病温度，为丝黑穗病的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料：初次鉴定材料2012年270份，2013年300份，2014年290份，2015年304份，共1164份玉米种质资源，包括 900份玉米自交系、261份农家种和3份群体材料，其中国外引进种质205份，均由中国农业科学院作物科学研究所提供。

表1 供试玉米材料来源与数量Table 1 Origin and number of maize germplasm

1.2 试验方法

1.2.1种质资源抗性鉴定 丝黑穗病原冬孢子：将上年从典型病株上采集的病瘿，装布袋于通风处越冬，由甘肃省农业科学院植物保护研究所采集并保存。播种前1周将病瘿上的菌粉抖落，用40目细筛筛出冬孢子，按0.1%比例与细土充分混合配成菌土备用。

鉴定圃设在甘肃省天水市甘谷县新兴镇五甲村，甘肃省农业科学院植物保护研究所甘谷试验站，年平均气温为9.5～10.9℃，降雨量为480 mm左右，无霜期约180 d。由于种质资源抗性鉴定具有材料多、种子量较少的特点，因此抗性鉴定均采用无重复鉴定方式，于2012—2015每年4月中旬进行田间春播，每份材料均按单行人工穴播种植，行长约10 m，行、穴距为40 cm×40 cm。每穴点播种子4粒，覆盖菌土100 g。待4～5叶1心期，每穴随机留苗2株。根据每年材料数量在鉴定圃内设Mo17(R)和黄早四(HS)对照5组及以上。

参照中华人民共和国农业部颁布的玉米抗丝黑穗病鉴定技术规范进行[19]。病情分级和抗性分级标准为：1级：病株率0～1.0%，高抗(HR)；3级：病株率1.1～5.0%，抗(R)；5级：发病株率5.1～10.0%，中抗(MR)；7级：发病株率10.1～40.0%，感(S)；9级：发病株率40.1～100%，高感(HS)。在玉米进入乳熟期后，对供试材料逐株进行调查，记载总株数，发病株数，计算发病率。根据病株率，评价供试材料的抗感水平。供试材料在初次鉴定中表现为抗性及高抗时，次年进行重复鉴定。

1.2.2土壤温度和接菌量试验 土壤温度对玉米丝黑穗病发病影响：播期试验安排在同一试验地块中，试验地前5茬均种植小麦，于2016年4月17日开始播种，每3天播种1次，即2016年4月17日、4月20日、4月23日、4月26日、4月29日、5月2日和5月5日分别播种玉米自交系黄早四，行长约5 m，行、穴距为60 cm×20 cm，每穴点播种子2粒，覆盖菌土100 g，每次设4次重复。土壤温度采用人工智能气象站，购自Campbell Scientific，Inc，数据采集器型号：CR6，采集0～10 cm的日平均地温，土壤温度为播种到出苗时的0～10 cm的平均地温。

接菌量对玉米丝黑穗病发病影响：于2016年4月20日播种玉米品种沈单16，分别按0.1%,0.2%和0.3%的比例，将菌粉与细土充分混合配成菌土覆盖玉米种子，行长约5 m，行、穴距为60 cm×20 cm，每穴点播种子2粒，每个处理设4次重复。

2 结果与分析

2.1 不同地理来源与不同类型玉米种质对丝黑穗病的抗性水平

针对不同地理来源的种质资源，比较了6个不同省份种质(份数较多)的抗性情况，在内蒙古、山西、云南、黑龙江、河北和广东种质中，抗丝黑穗病(HR+R)种质占比分别为11.34%、5.13%、0.83%、14.86%、9.38%和0.00%，表明我国不同地区玉米种质的抗丝黑穗病强弱以及抗性多样性存在较大的差异，来自于云南和广东的种质，其整体抗性水平明显低于内蒙古和黑龙江。在7个筛选出高抗自交系的地区中，内蒙、美国、黑龙江、山西、云南、河北和陕西占供试自交系比例分别为1.56%，1.44%，0.44%，0.33%，0.11%，0.11%和0.11%。

如图1所示，在鉴定的1164份玉米种质中，38 份材料表现高抗，61 份材料表现抗，140份表现中抗，566 份表现感，359份表现高感，分别占总材料的3.26%，5.24%，12.03%，48.63%和30.84%。由图2可知，表现中抗以上的自交系共226份，占供试自交系的25.11%，而表现中抗以上的农家种仅12份，占供试农家种的4.60%，因此，在玉米丝黑穗病的抗性水平上，农家种的抗性低于自交系。

2.2 自交系对丝黑穗病的抗性水平

在900份国内外自交系中，37份自交系如丹599,L91073,866,173,KH13,03GEM00041,03GEM00065(1),03GEM00110,03GEM00126(2),03GEM00142(2),03GEM00148,04GEM00277(1),04GEM00768(2),04GEM00770(1),07GEM02289,07GEM02902,07GEM02919(2),07GEM02935,yc00(30-1),H11,05-881,BR27,YH09-272,B07144,cf-1,B07137,H1535,7022,cf-4,664062,B07013,沈11-16,88017,7408,7435,7505,7541表现高抗(HR)；58份自交系如W6,478,4619,沈137,A580,KL53,KL4,郑22,郑653,郑58,陇0205,W6765/Su,2010X450,09H144,65长35,D-091,gs18,赤H16,赤H9,法7-1,鄂系3,赤019,巴系504,M12,赤74592等表现抗(R)；131份自交系如5320,W22,W216,W286,选502,T405,T409,哲5762,D2374,赤L111,赤L160,辽自四,KL57,A461,A451,KL2B,KH13等表现中抗(MR)；库6-49,472-3,T432,W15,W78,W103,W218,W236,W253,W256,W257,W277,W298等398份表现感病(S)；而P78选3-1,白53,廊H,DJ28,W17,W77,W238,W239,W456,W473,W582,早215等279份表现高感(HS)，分别占供鉴自交系的4.1%，6.4%，14.6%，43.9%和31.0%(图2)。表现高抗和抗的自交系见表3。

图1 玉米种质所占抗性比例Fig.1 The proportion of resistance types of maize germplasms

图2 自交系和农家种分别所占抗性比例Fig.2 The proportion of differen resistance types of inbred lines and landraces respectively

2.3 农家种对丝黑穗病的抗性水平

在供鉴的261份国内外农家种中，1份材料SW91D-323-7 Ki1414表现高抗(HR)；3份02GEM80058、04GEM80040和04GEM00765表现抗(R)；8份86122-1-1、B681、老乌糯(232338)、糯包谷(232265)、04GEM80014、03GEM80037、07GEM 80044、M98表现中抗(MR)；Pob43C3、Pob49C2、Pob28C2、Pob502、冀群4、Z83149-1-2、中杂选1、B690、B711、B721、粤C10、粤C10-1、粤C0-M2、粤C1-P、粤C1-M、粤C1-PM等170份表现感病(S)；Pob32 C2、Stay GreenC4、P039-5-1、86039-5-1、Z83149-2-1,86102-1-1,86田野-2、86102-2-1-1-2、6161-17、吉单71986、B67-512等79份表现高感(HS)，分别占供鉴农家种的0.4%，1.1%，3.1%，65.1%和30.3%，见图2。表现高抗和抗的农家种见表4。

续表4

续表4

2.4 群体材料对丝黑穗病的抗性水平

在来自中国上海的3份群体材料中，未发现表现高抗和抗的材料，中抗、感和高感各1份，分别为91at692、91at690和91at691。

2.5 不同农家种抗玉米丝黑穗病聚类分析

不同来源农家种材料41份，根据其对玉米丝黑穗抗性反应表型相似程度的差异，以最长距离法λ=18.57，可以将41农家种材料用聚类分析法绘成谱系图(图3)。其中第1类为高抗性材料，为SW91D-323-7 Ki1414，发病率为0；第2类为抗性材料，由04GEM00765、04GEM80040和02GEM80058共3份材料组成，发病率在2.2%～3.85%；第3类是中等抗性材料，包括白洋包谷、B681、糯包谷、老乌糯等共9份材料，发病率在6.25%～12.82%；第4类为感病材料，分别为D48C2、MIRSyn C3、粤C0-1、白马牙等13份材料，发病率在19.1%～39.13%；第5类为高感病材料，由紫包谷、PEM、D9C2、小黄玉米等共15份材料组成。

2.6 土壤温度和接菌量对发病的影响

调查结果显示，0～10cm地温在14.3～18.7℃，发病率在60.47%～90.21%。温度为18.7℃，发病率最低，病株率为60.47%，与其它6个温度差异较显著(P<0.05)；温度为15.8℃，黄早四的病株率高达90.21%，与地温16.3℃和17.9℃2个处理间差异不显著(P>0.05)，但与其它处理间差异显著(P<0.05)。分析发现，温度在15.8～17.9℃，病株率在85%以上(表5)。研究发现，接菌量为0.1%,0.2%和0.3%时，病株率分别为33.55%,45.02%和48.48%，即病株率与接菌量成正相关(图4)。

图3 农家种玉米品种对丝黑穗病抗性最长距离法聚类分析谱系图Fig.3 The clustering analysis drawing on the disease resistance of maize peasant resources by Longest Distance Method(LDM)

表5 温度对发病率的影响Table 5 The effects of temperature on disease incidence

图4 接菌量对发病率的影响Fig.4 The effects of inoculum amount on disease incidence

3 讨论

目前抗丝黑穗病鉴定方法有幼苗的褪绿斑点鉴定、质壁分离法鉴定、乳酚油棉兰染色玉米生长锥鉴定等方法[20-22]，此类方法测定的结果都停留在相关性描述上，没有给出相关的性状测定方法和抗性评价标准，一直无法用于抗性资源鉴定[23]。上述每种方法都有一定的局限性，如在苗期利用侵染叶片上褪绿斑点的形成来鉴定抗病性的方法仅适用于自交系[24-25]。苗期症状也并不十分稳定，常因品种抗病性、菌源量及土壤环境而变化，苗期症状易与其它病毒病、生理病害及机械伤害等所致症状相混淆，所以只能作为早期诊断的参考。目前通用也是最稳定的鉴定方法是接种后乳熟期进行发病率鉴定[25-27]，因此，本研究利用人工接种进行了抗丝黑穗病筛选，通过初次鉴定和重复鉴定，筛选出具有抗性种质238份，占供试材料的20.45%，可为育种部门提供核心抗源。然而高抗种质仅38份，占3.26%，表明高抗种质极其匮乏，这与郭成等[18]研究结果一致。

华致甫等[28]用妇人指等5个自交系作为鉴别寄主，对来自新疆等9个省区的丝黑穗菌标样的致病力及其酸性磷酸酯酶和酯酶同工酶试验，认为在我国玉米丝黑穗病菌中至少存在5个生理小种，甘肃、四川、吉林、陕西、云南是1号，为优势小种。由此可见，甘肃玉米丝黑穗病菌致病力强，极具代表性，所以该批次材料对丝黑穗病的抗性评价分析比较客观和准确。

本研究中筛选出自交系和农家种中表现中抗以上的种质分别占总鉴定种质的25.11%和4.60%，表明玉米自交系中的抗性资源较农家种丰富，这与段灿星等[5]对腐霉茎腐病和镰孢穗腐病研究结果一致。研究结果同时表明不同地区玉米种质对丝黑穗病抗性强弱以及抗性多样性存在较大的差异，来自云南和广东的种质对丝黑穗病的抗性水平明显低于内蒙古和黑龙江。

聚类分析的功能是建立一种分类方法，它将一批样品或变量按照它们在性质上亲疏程度进行分类[29]。本文采用聚类分析方法对玉米材料抗性进行研究，在对41个农家种玉米种质进行抗丝黑穗的系统分析中，利用DPS软件用最长距离法进行了聚类分析。结果表明，41份材料可划分为5类。在谱系图上，抗病性相同的品种大致划分在同一个类中，但通过比较它们的谱系图和农业部颁布的玉米抗丝黑穗病鉴定技术规范划分的抗病类型，发现两者之间存在一定的偏差，如农家种白洋包谷发病率为12.82%，根据玉米丝黑穗病鉴定技术规范应划分为感病，但在聚类分析图中却将其与B681、糯包谷、老乌糯等8个中抗材料归为一类，由此可见，聚类分析在实际应用中存在一定的局限性，但可以作为抗性评价的参考依据。

4 结论

本研究鉴定出38 份高抗种质，61 份抗病种质，140份中抗种质，566 份感病种质和359份高感种质。研究发现玉米自交系中的抗丝黑穗病资源较农家种丰富，不同地区玉米种质抗性强弱以及抗性多样性存在较大的差异，来自云南和广东的种质其抗性水平明显低于内蒙古和黑龙江。研究结果同时表明0～10 cm的土壤温度在15.8～17.9℃，为玉米丝黑穗病发病的温度，其中15.8℃为最佳发病温度；随着接菌量的增加，病株率也随之增加，发病愈加严重。