结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的价值及影响因素

夏青 桂淑玉 韩莙

安徽医科大学第一附属医院呼吸与危重症学科（合肥230022）

我国是世界上22个结核病高发国家之一，每年因结核病死亡病例达13万例。结核病是一种慢性传染病，其致病菌为结核分枝杆菌。结核分枝杆菌能够侵犯机体的多个脏器，最常见的是肺结核，这些疾病都会对人体造成极大的危害。结核分枝杆菌感染后的临床症状相当复杂，特别是肺外结核感染，其临床表现较为隐匿，症状不典型，常常容易导致误诊、漏诊。因此，如何能够快速、准确的诊断结核病，有效的控制结核病的继续蔓延，已经成为公共卫生需要重视的问题。现代医学对于结核病的诊断多是在临床症状的基础上，结合结核菌培养、抗酸杆菌涂片、X线检查、结核菌素试验及血清TB-Ab结果进行确诊。但因所需时间长、敏感度低、假阳性高、假阴性高等问题，不能及时、有效的诊断结核病，耽误患者病情。近年来研究人员发现，人体内的效应T细胞［1］再次被暴露的抗原刺激，会在体外释放γ干扰素。基于这一研究发现，国外学者提出T-SPOT.TB检测法，利用结核特异抗原ESAT-6及CFP-10，通过酶联免疫斑点技术ELISPOT检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌。该检测手段具有灵敏度高、特异性强等优点。但T-SPOT.TB仍存在一定的假阳性率和假阴性率，很少有报告探讨T-SPOT.TB的影响因素。本研究通过对我院疑似结核病患者325例进行T-SPOT.TB、PPD和血清TB-Ab检查，分别研究其对结核病诊断的敏感度、特异性、假阳性率和假阴性率，探讨其在结核病诊断中的价值，并研究患者性别、年龄及血液中各项指标对T-SPOT.TB的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集我院2015年1月至2017年5月住院期间的疑似结核病患者325例，其中男224例，女101例，年龄8～95岁，平均（50.11±19.83）岁。纳入标准：有咳嗽、咳痰、午后低热或咯血等症状，胸部X线或相应部位影像学检查异常，排除AIDS感染、急性病毒感染、应用免疫抑制剂、妊娠等免疫功能影响患者。按照最终确诊结果分为结核性疾病组和非结核性疾病组。其中，结核性疾病组254例，非结核性疾病组71例。结核性疾病组纳入标准（满足任意一项）：（1）涂片抗酸杆菌或分枝杆菌培养阳性；（2）病理活检提示结核；（3）临床表现和影像学表现符合典型结核性改变，且抗结核治疗有效。非结核性疾病组纳入标准（满足任意一项）：（1）病理检查明确肿瘤并排除结核分枝杆菌感染；（2）病理检查确定为其他病原体感染；（3）抗结核治疗无效，经其他非抗结核治疗有效。

1.2 仪器和试剂HealForce培养箱、T-SPOT.TB试剂盒采购于英国Oxford Immunote Ltd公司；酶联免疫荧光斑点分析仪采购于德国AID公司；淋巴细胞分离液、Gibco AIM-V、Gibco RPMI 1640细胞培养液采购于上海复星长征医学科学有限公司。

1.3 实验操作程序

1.3.1 T-SPOT.TB结果判断T-SPOT.TB实验结果包括阴性对照，阳性对照，抗原A和抗原B。（1）实验有效的标准：阴性对照孔内斑点形成细胞计数＜10个，且阳性对照孔内斑点形成细胞计数＞20个。（2）阳性结果判断标准：①阴性对照孔斑点数为＜6个，且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（阴性对照孔斑点数）＞6个；②阴性对照孔斑点数为＞6个，且（抗原A或抗原B孔的斑点数）＞2倍（阴性对照孔斑点数）。满足阳性结果判断标准任意一条均为阳性，否则为阴性［2］。

1.3.2 PPD结果判断硬结平均直径＜5 mm为阴性，直径范围5～9 mm为弱阳性，10～19 mm为阳性，≥20 mm或虽＜20 mm但局部出现水泡和淋巴管炎为强阳性反应［3］。

1.3.3 血清结核抗体检测采用胶体金法，试剂由南京大渊生物技术工程有限责任公司提供。

1.3.4 NLR、PLR计算选择患者入院时血常规、白蛋白检测结果，并计算NLR、PLR。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，进行t检验。计数资料以率表示，用χ2检验。应用logistics回归分析评估性别、年龄、血常规及白蛋白对T-SPOT.TB的影响，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床诊断结果325例疑似结核病患者中，确诊为活动性结核病254例，包括肺结核（包括肺结核合并肺外结核）230例、肺外结核（包括结核性胸腔积液、骨结核、结核性脑膜炎、乳房结核、淋巴结结核等）24例，非结核病患者71例（包括肺炎、支气管扩张、肺癌、尘肺、肺脓肿、间质性肺炎等）。

2.2 各组患者T-SPOT.TB试验结果T-SPOT.TB试验结果显示，活动性结核病254例患者，阳性有200例，敏感度 78.74%（200/254），假阴性率21.26%（54/254）；非结核性疾病患者71例，阴性患者有54例，特异性76.06%（54/71），假阳性率23.94%（17/71），见表1。

表1 各组患者T-SPOT.TB试验结果Tab.1 T-SPOT.TB test results of patients in each group例（%）

2.3 各组患者PPD试验结果PPD诊断活动性结核病的敏感度为54.72%（139/254），特异性为71.83%（51/71），假阳性率为28.17%（20/71），假阴性率为45.28%（115/254）。见表2。

2.4 各组患者血清TB-Ab试验结果血清TB-Ab诊断活动性结核病的敏感度为40.94%（104/254），特异性为77.46%（55/71），假阳性率为22.54%（16/71），假阴性率为59.06%（150/254）。见表3。

表2 不同类型患者PPD实验结果Tab.2 PPD experimental results of different types of patients例（%）

表3 不同类型患者血清TB-Ab实验结果Tab.3 SerumTB-Ab test results of different types of patients例（%）

2.5 对活动性结核病组、非结核病组分别进行TSPOT.TB、PPD试验和血清TB-Ab三种方法检测三种方法对结核病和非结核病的检出差异均具有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 三种检测方法分别在结核病组、非结核病组的比较Tab.4 Comparison of the three detection methods in the nontb group in the tuberculosis group

2.6 三种检测方法在结核病诊断方面比较差异具有统计学意义（χ2=90.00，P＜0.001），见表5。

表5 三种检测方法对结核病检出率的比较Tab.5 Comparison of TB detection rates between the three detection methods

2.7 Logistics回归分析性别、年龄、白细胞计数、淋巴细胞绝对值、中性粒细胞绝对值、血小板计数、血红蛋白、白蛋白、PLR、NLR对T-SPOT.TB的影响。回归分析过程中，中性粒细胞和血小板未通过模型显著性检验。性别、年龄对T-SPOT.TB无显著性影响（P＞0.05）。白细胞对T-SPOT.TB系数为0.158，但白细胞对T-SPOT.TB无显著性影响（P＞0.05）。淋巴细胞与T-SPOT.TB呈正相关（r=10.53，P＜0.05）。血红蛋白和白蛋白对TSPOT.TB无显著性影响（P＞0.05）。NLR与T-SPOT.TB呈负相关（r=-2.146，P＜0.05），PLR与T-SPOT.TB呈负相关（r=-0.125，P＜ 0.05）（表6、7）。

3 讨论

结核病仍然是本世纪严重危害人类健康的主要传染病之一，具有传染性强、发病率高、隐匿性强和临床症状不典型等特点，是全球关注的公共卫生和社会问题。世界卫生组织统计，每年约有900万例新发的结核感染病例，特别是肺结核［4］。现如今，世界卫生组织把印度、中国、俄罗斯、南非、秘鲁等22个国家列为结核病高负担、高危险国家，全球80%的结核病例集中在这些国家，严重影响了这些国家人民的生存质量。因此早期、快速准确诊断结核病，是目前发展中国家防治结核发生的重要工作。

传统意义上，进行结核病原学［5］的检查是诊断结核病的金标准。但病理学检查对患者造成较大的创伤，临床实施具有一定的困难，常规的结核菌培养需要时间较长，培养条件比较高，而且受到标本质量和结核菌数量的影响，假阴性率较高，痰涂片检出率也相对较低。因此，在临床诊断中，病原学检查的方法并不普及。目前，临床上多采用结核菌素试验（PPD）［6］，结核菌素试验是一种临床广泛常用的结核筛查方法，向患者皮下注入结核菌素，通过主动免疫，注射后48～72 h内密切关注硬结大小，最后将硬结大小与不同标准进行比较，得出判断结果。该方法具有操作简单，检测快速等优点，常作为诊断性抗结核治疗的实验室检查依据。但由于我国人群卡介苗接种率较高，存在PPD假阳性率较高的情况，并且机体自身免疫状态很容易影响PPD试验的结果，这一缺点严重限制了该方法在临床上的应用。血清TB-Ab操作简单，检测快速，常被临床采用，但溶血样本和高脂血样本不宜，且易受免疫功能影响，疾病急性感染的早期，易出现阴性结果，假阴性率较高（本试验中，假阴性率达59.06%），敏感度低，临床应用价值有限。这些问题的存在，严重限制了结核病的准确诊断和有效治疗。

表6 各指标对T-SPOT.TB的影响Tab.6 Influence of each indicator on T-SPOT.TB

表7 各指标对T-SPOT.TB的影响Tab.7 Influence of each indicator on T-SPOT.TB

近年来，T-SPOT.TB试验凭借其在诊断结核分枝杆菌感染方面具有敏感性高、特异性强的特点，被逐渐推广，用来诊断结核杆菌感染。自2006年该方法被相关部门认证，越来越多的研究证明该方法的优势。T-SPOT.TB是由酶联免疫斑点［7］发展而来的检测结核疾病的新型方法。T-SPOT.TB对T淋巴细胞的反应十分灵敏，其作用机理是通过检测是否存在结核感染T淋巴细胞后分泌的特异性细胞因子干扰素γ来明确患者有无结核感染。多项研究表明［8-11］，T-SPOT.TB对于诊断结核病的敏感度和特异性较高，同时T-SPOT.TB的敏感性不会受到机体免疫状态的影响。随着近些年对T-SPOT.TB的研究发现，该方法在检测活动性结核病时，对机体状态的影响小。当结核分枝杆菌被清除后，机体内的效应T细胞就会立即消失，因此，T-SPOT.TB试验不仅适用于结核分枝杆菌感染患者，也能很好的反映患者的预后情况，还有利于胸腔积液内单个核细胞的检测，能够更加灵敏、准确地反应胸腔结核分枝杆菌感染的情况。本研究结果表示，对于鉴别结核病和非结核病，T-SPOT.TB、PPD试验和血清TB-Ab差异均有统计学意义（P＜0.001），同时，在比较T-SPOT.TB、PPD试验和血清TB-Ab对结核病的诊断效果时，本研究通过不同类型的结核病，比较各自的敏感度、假阳性率、假阴性率等结果发现，在抗酸杆菌涂片、结核分枝杆菌病原学检查等手段［12］确诊的结核患者中，T-SPOT.TB的敏感度（78.74%）明显高于PPD试验、血清TB-Ab（P＜0.001），且特异性（76.06%）高。

但T-SPOT.TB仍存在假阳性率23.94%、假阴性率21.26%。本研究中，男224例，女101例，年龄8～95岁，性别及年龄对T-SPOT.TB均无显著性影响，血红蛋白和白蛋白对T-SPOT.TB无显著性影响。说明老年患者、贫血患者或者低蛋白血症患者，虽免疫功能低下，对T-SPOT.TB结果影响较小。与以前的多项研究［13-14］一致。

结核病主要的免疫保护机制是细胞免疫，淋巴细胞是主要的免疫调控细胞。当人体受结核分枝杆菌的感染，巨噬细胞立即作出反应，大量分泌白细胞介素-1和肿瘤坏死因子等细胞因子使淋巴细胞聚集到结核分枝杆菌入侵部位，逐渐形成肉芽肿，限制并杀灭结核分枝杆菌。本研究中，淋巴细胞对T-SPOT有显著性正向影响，淋巴细胞升高，易引起特异性免疫反应。中性粒细胞具有很强的趋化作用和吞噬能力，当局部发生感染时，中性粒细胞可以快速穿越血管内皮细胞进入受侵部位，对感染的病原体发挥吞噬功能和清除作用，它可以调节淋巴细胞活性［15］，血小板是凝血的重要因子，在免疫调节中作用显著［16］，NLR、PLR作为炎症标志物，反映体内炎症细胞因子水平，已被用于不同肿瘤疾病和炎症疾病中的分期及预后影响因素［17-21］。本研究中，NLR、PLR对T-SPOT.TB均有显著性负向影响。因此，对疑似结核病患者进行T-SPOT.TB检测时，尚需考虑此患者的淋巴细胞绝对值、NLR及PLR对检测结果的影响。但本研究数据偏少，应继续扩大样本量加以研究。

综上所述，T-SPOT.TB对结核病诊断有较高的敏感度和特异性，抽血24 h后便能得出诊断结果，准确、快捷。但是该试验也存在一些技术和其他方面的问题。目前临床上利用该方法检测结核分枝杆菌的费用比较昂贵，并且操作步骤比较繁琐，对实验室的技术要求也比较高，受淋巴细胞、NLR、PLR的影响较大，需综合分析其试验结果。但其在诊断结核感染方面有突出的优势，因此，临床上有疑似结核感染的患者进行T-SPOT.TB检测，无疑可减少结核感染的漏诊，也值得临床应用和推广。