DLL1基因在乳腺癌及三阴性乳腺癌中的表达及其临床意义

吴珏堃 熊志勇 阮莹 刘宇

1中山大学附属第三医院甲状腺乳腺外科（广州510630）；2中山大学附属第三医院岭南医院普外科（广州510630）

乳腺癌是女性最常见、病死率最高的恶性肿瘤之一［1］。乳腺癌的发生与遗传、激素影响、生活方式等因素相关，但其具体发病机制尚未明确。乳腺癌的发生发展过程复杂，涉及多条信号通路。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer）是一种侵袭性乳腺癌亚型，指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）均表达阴性的乳腺癌分子分型，其病理分期更差、患者生存率更低［2］。与激素阳性乳腺癌相比，现有的化疗及靶向治疗方案对三阴性乳腺癌作用有限［3］。

Notch信号通路是一种进化上高度保守的通路，在胚胎发育和组织稳态维持过程中起着至关重要的作用。异常的Notch信号转导与多种人类遗传病以及肿瘤生物学的多个方面有关，包括干细胞更新、癌细胞增殖、肿瘤血管生成和转移［4］。研究表明Notch信号通路可调控乳腺癌及乳腺癌干细胞的增殖、分化和凋亡［5］，Notch信号作为许多疾病的潜在治疗靶点得到了越来越多的关注，针对Notch信号通路的靶向治疗药物也有可能给乳腺癌的治疗带来新方向。

目前对Notch信号通路中的DLL1基因在乳腺癌中的表达及作用鲜有报道，本研究通过肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，研究DLL1在乳腺癌及三阴性乳腺癌中的表达差异的临床意义及对预后生存的影响，为进一步研究DLL1在肿瘤发生发展中的作用机制提供线索和思路。

1 材料与方法

1.1 数据资料收集利用Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA数据库（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga）下载并预处理乳腺癌及三阴性乳腺癌数据集的mRNA表达数据，利用Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast）在线分析DLL1与乳腺癌及三阴性乳腺癌患者预后的相关性。

1.2 数据集的筛选和临床资料参数相关性研究提取TCGA数据集中乳腺癌及三阴性乳腺癌病例中的临床参数和生存资料数据。根据DLL1表达量的资料，将数据按照中位数二等分，分别设为高表达组和低表达组。

1.3 统计学方法计量资料以均数±标准差表示，应用SPSS 17.0统计软件分析。均数比较采用t检验和方差分析，基因表达与患者临床病理参数之间的关系采用Pearson卡方检验。

2 结果

2.1 DLL1基因在乳腺癌和三阴性乳腺癌中的表达利用TCGA的数据我们分析了DLL1基因在113例正常乳腺组织、1 090例乳腺癌及66例三阴性乳腺癌中mRNA的表达情况（图1），DLL1在乳腺癌中的相对表达水平为2.28±0.07，明显低于正常乳腺组织的相对表达水平3.83±0，14（t=7.471，P＜0.01）。DLL1在三阴性乳腺癌中的相对表达水平为2.07±0.24，明显低于正常乳腺组织的相对表达水平（t=6.789，P＜0.01）。DLL1在乳腺癌中的相对表达水平与三阴性乳腺癌的差异无统计学意义（t=0.773，P=0.44）。

图1 DLL1基因在乳腺癌和三阴性乳腺癌中的表达水平Fig.1 Expression of DLL1 gene in breast cancer and triplenegative breast cancer

2.2 DLL1表达与临床病理资料相关性在乳腺癌中，DLL1的表达与ER、PR、年龄、病理组织类型的相关性差异有统计学意义（P＜0.01），与HER2、绝经、种族、远处转移、淋巴结转移相关性差异无统计学意义（P＞0.05）。在三阴性乳腺癌中，DLL1的表达与年龄、病理组织、绝经、种族、远处转移、淋巴结转移均无明显相关性（表1）。

2.3 DLL1表达与乳腺癌及三阴性乳腺癌预后的相关性为分析DLL1的表达与乳腺癌预后的相关性，本研究从TCGA数据库中下载了乳腺癌DLL1 mRNA表达数据和相应肿瘤患者生存时间数据，利用Kaplan-Meier Plotter对这些肿瘤的数据集进行在线生存分析。结果发现，DLL1的表达与乳腺癌患者的总生存期（HR=0.65、P=0.018）（图2）、无病生存期（HR=0.59、P＜0.001）（图3）有相关性，DLL1表达越低，乳腺癌患者总生存时间和无病生存时间更短。在三阴性乳腺癌中，由于总生存期数据较少无法统计分析，DLL1的表达与三阴性乳腺癌患者的无病生存期（HR=1.77、P=0.038）有相关性（图4），在三阴性乳腺癌患者中，DLL1表达越低，乳腺癌患者无病生存时间更长。

3 讨论

Notch信号通路由Notch受体、Notch配体（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，suppressor of hairless，Lag的合称）DNA结合蛋白、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。哺乳动物有4种Notch受体（Notch1～4）和5种Notch配体（Delta-like 1，3，4，Jagged1和Jagged2）［7］。Notch 信号通路在进化上十分保守，存在于许多动物体内。Notch位于细胞信号通路的交汇点，通过受体与配体的相互作用传递细胞信号，在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用。包括癌症在内的许多人类疾病，都存在Notch信号的调控错误［8］。

表1 DLL1表达与乳腺癌及三阴性乳腺癌临床病理特征的相关性Tab.1 Correlation between DLL1 expression and clinicopathological features of breast cancer and triple-negative breast cancer 例

在肿瘤的发生发展中Notch信号通路发挥了重要的作用，其中DLL1在肺癌［9］、胰腺癌［10］、胶质母细胞瘤［11］等多种肿瘤中表达异常，但DLL1在乳腺癌中的作用如何目前研究较少。

乳腺干细胞在乳腺发育及乳腺癌的发生中起着重要作用，研究表明乳腺干细胞能够产生大量的DLL1，DLL1与Notch2和Notch3受体的结合对保持乳腺细胞处于干细胞状态及其微环境中的巨噬细胞数量至关重要，同时DLL1的表达导致巨噬细胞表达Wnt3、Wnt10和Wnt16基因，这种发生在乳腺干细胞微环境中的“Notch-Wnt交谈”对乳腺发育是至关重要的，这种机制也可能对乳腺癌产生，因为在乳腺癌中这些信号传导通路的活性异常增加［12］。

图2 DLL1表达对乳腺癌总生存期影响Fig.2 Effect of DLL1 expression on overall survival of breast cancer

图3 DLL1表达对乳腺癌无病生存期影响Fig.3 Effect of DLL1 expression on breast cancer free survival

图4 DLL1表达对三阴性乳腺癌无病生存期影响Fig.4 Effect of DLL1 expression on three negative breast cancer free survival

本研究利用TCGA的数据分析了DLL1基因乳腺癌中mRNA的表达情况发现DLL1在乳腺癌及三阴性乳腺癌中均均明显低于正常乳腺组织。进一步结合临床病理资料分析，发现在乳腺癌中，DLL1在不同ER、PR、年龄、病理组织类型的表达差异有统计学意义，在不同HER2、绝经、种族、远处转移、淋巴结转移的表达差异无统计学意义。在三阴性乳腺癌中，DLL1在年龄、病理组织、绝经、种族、远处转移、淋巴结转移的表达差异均无统计学意义。生存分析显示DLL1表达越低，乳腺癌患者总生存时间和无病生存时间更短，但是在三阴性乳腺癌患者中，DLL1表达越低，乳腺癌患者无病生存时间更长。雌激素受体、孕激素受体的相关性预示着DLL1在三阴性乳腺癌中的可能发挥的不同的作用机制，在三阴性乳腺癌中，低表达DLL1反而无病生存期更差，表明DLL1在三阴性乳腺癌的复发机制中可能有所不同。

现有的研究对DLL1的功能了解很少，本文通过生物信息学分析为DLL1基因的功能学研究提供了基础。本研究的不足之处在于TCGA数据库提供的是mRNA表达水平的数据，不能完全替代蛋白水平的表达情况，后续研究应进一步在临床样本中综合mRNA和组织蛋白层面验证DLL1的表达情况，并在体内外实验中检测DLL1表达差异对乳腺癌功能的有无影响。综上所述，DLL1在乳腺癌的发生发展中有着密切相关性，对其深入的研究可进一步揭示其在乳腺癌中的功能及作用机制，深入的研究可为肿瘤的预防和治疗提供新的思路。