Hic-5基因在胆管纤维化中的表达

罗程 陈琪 方程 罗斌 苏松 夏先明 李波

西南医科大学附属医院肝胆外科（四川泸州 646000）

胆管纤维化作为导致胆管狭窄的主要原因之一，是一种严重的病理过程。目前研究发现Hic-5（hydrogen peroxide-inducible clone5）基因参与了多种纤维化疾病的发生发展过程，如肾小球硬化、增生性视网膜病变等，其可以通过对TGF-β1进行调控，促进组织纤维化的发生［1-6］。TGF-β1作为机体致纤维化最主要的细胞因子之一，当大鼠胆管发生纤维化时，其表达水平显著升高［7］。那么，在纤维化的胆管组织中Hic-5的蛋白表达情况如何，与TGF-β1是否存在着相互调控关系，有待于进一步的研究。因此，本项目通过对大鼠纤维化胆管组织中Hic-5和TGF-β1的蛋白表达情况以及两者的相互关系进行研究，探讨纤维化胆管中Hic-5的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料随机选取30只SD大鼠（4～6周龄，体质量200～400 g），平均分为手术组（胆管持续钳夹90 min），假手术组（仅解剖分离胆管）和正常组。

1.2 方法

1.2.1 标本采集3组大鼠常规饲养21 d后予以脱颈处死，腹部脱毛处理并沿腹中线原切口处切开腹壁（开口约5 cm），逐层分离皮下组织、肌肉和部分粘连，充分暴露十二指肠上段，探查见一淡黄色液体（胆汁）充盈的管道即为胆管，并于肝脏乳头叶侧钝性分离并裸化胆管，在肝脏和十二指肠入口处之间切取胆管组织（长约3.5 cm）。

1.2.2 标本检测步骤（1）将离体的大鼠胆管组织进行固定剂（4%多聚甲醛）固定并脱水，常规石蜡包埋切片并进行抗原修复；（2）采用Masson染色法进行组织中的纤维染色，明确纤维化的胆管组织；（3）免疫组织化学法进行胆管组织中Hic-5和TGF-β1的抗原染色；（4）将离体胆管组织研碎，并加入RAPI裂解液进行组织裂解，离心后取上清进行蛋白变性，并通过蛋白印迹法检测纤维化胆管组织中Hic-5和TGF-β1的表达。

1.2.3 观察指标及结果判断（1）Masson染色：胶原纤维将被苯胺蓝试剂染为蓝色条索，胆管纤维化时，胆管周围将呈现明显的蓝色条索结构即为纤维组织；（2）免疫组织化学法：目的蛋白的阳性表达将出现黄褐色的染色，胆管纤维化时，观察Hic-5和TGF-β1在胆管组织中的阳性表达及分布；（3）蛋白印迹法：半定量的检测目的蛋白的表达情况，胆管纤维化时，观察Hic-5和TGF-β1的条带灰度值情况。

1.3 统计学方法采用SPSS 18.0统计分析软件进行数据的分析处理，分析方法为one-way ANOVA，检测水平α=0.05，结果均采用均数±标准差（±s）进行表示，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。指标间的相关性采用Pearson法进行分析。

2 结果

2.1 Masson染色结果蓝色的纤维条索结构主要分布于手术组的胆管组织中，而正常组和假手术组相对较少（图1，F=91.69，P ＜0.001）。手术组的纤维化程度（蓝色纤维结构表达量）明显大于正常组和假手术组（P＜0.001），虽然假手术组的纤维化程度略高于正常组，但其差异无统计学意义（P ＞ 0.05）（图2）。

图1 胆管组织的Masson染色Fig.1 The Masson test of bile duct tissue

2.2 免疫组化结果

2.2.1 Hic-5的免疫组化结果阳性染色颗粒主要分布于手术组的胆管组织中，并围绕于胆管上皮细胞，而假手术组和正常组均只有少量表达，其差异具有统计学意义（图3，F=587.7，P ＜0.001）。手术组的阳性染色（黄褐色表达量）明显高于正常组与假手术组（P＜0.001），虽然假手术组的阳性表达程度略高于正常组，但其差异无统计学意义（图4，P ＞ 0.05）。

图2 各组间胆管纤维化相对面积比Fig.2 Relative area rate of bile duct fibrosis between groups

2.2.2 TGF-βl的免疫组化结果阳性染色颗粒集中表达于手术组的胆管组织中，表达区域宽且多，并弥散于胆管上皮细胞间，而假手术组和正常组均只有少量散在的表达，其差异具有统计学意义（图5，F=561.1.7，P ＜ 0.001）。手术组的阳性染色（黄褐色表达量）明显高于正常组与假手术组（P＜0.001），虽然假手术组的阳性表达程度略高于正常组，但其差异无统计学意义（图6，P ＞ 0.05）。

2.2.3 Hic-5和TGF-βl的免疫组化结果相关性分析手术组的Hic-5和TGF-βl免疫组化表达量变化采用Pearson法进行相关性分析显示r=0.989 8，P＜0.001，表明Hic-5和TGF-β1在纤维化的胆管组织中的表达呈正相关关系。

图3 胆管组织的Hic-5免疫组化检测Fig.3 The immunohistochemistry test of Hic-5 inbile duct tissue

图4 各组间Hic-5光密度值比较Fig.4 Comparison of Hic-5 optical density values between groups

2.3 Hic-5和TGF-βl的蛋白表达Hic-5和TGF-βl于3组中的相对蛋白表达量分别为正常组（0.81±0.11，0.93±0.05），假手术组（0.75±0.08，0.84±0.13），手术组（1.48 ± 0.04，1.25 ± 0.04）（图7）。手术组的胆管组织中的Hic-5和TGF-βl蛋白表达显著高于正常组和假手术组，其差异具有统计学意义（P＜0.05），虽假手术组和正常组间存在差异，但其差异无统计学意义（P ＞ 0.05）（图8、9）。

2.4 Hic-5和TGF-βl的蛋白印迹法结果相关性分析手术组的Hic-5和TGF-βl相对蛋白表达量变化采用Pearson法进行相关性分析显示r=0.776 4，P＜0.01，表明Hic-5和TGF-β1的相对蛋白表达在纤维化的胆管组织中的呈正相关关系。

图5 胆管组织的TGF-βl免疫组化检测Fig.5 The immunohistochemistry test of TGF-βl inbile duct tissue

图6 TGF-βl光密度值比较Fig.6 Comparison of TGF-βl optical density values

图7 正常组、假手术组和手术组的胆管组织Hic-5和TGF-βl western blot结果Fig.7 Western blot results of Hic-5 and TGF-β1 in biliary tissues of normal group，sham group and model group

3 讨论

图8 Hic-5的western blot比较Fig.8 Western blot comparison of Hic-5

图9 TGF-βl的western blot比较Fig.9 Western blot comparison of TGF-βl

胆管纤维化是由于胆管组织损伤后以胆管上皮为中心的炎症和纤维化反应，并伴有进行性胆汁淤积，胆管增生，并最终导致胆管硬化狭窄和纤维化的一种病理性修复，进而诱发肝组织纤维化［8-9］。作为纤维化疾病中最为重要的细胞因子之一的TGF-βl，研究发现其在多种纤维化疾病中呈现显著的表达升高［10-14］。此外，研究还证实了在肝癌的发生中，TGF-βl是一个重要的诱导因素，可以增加肝癌的发生风险，这可能与TGF-βl参与肝纤维化的发生有着密切的关系［15］。胆管作为机体主要的管道器官组织之一，其对肝胆管系统的稳定发挥着至关重要的作用。但对于胆管组织纤维化疾病的研究却相对较少。本研究通过钳夹法致胆管梗阻进而引起胆管纤维化，手术组胆管呈现明显的纤维化状态。在手术组的胆管组织中，通过免疫组化检测分析显示TGF-β1的阳性表达明显升高，表达区域宽且多，并弥散于胆管上皮细胞间，相较于正常组和假手术组均具有显著的差异。同时将3组胆管组织进行半定量的蛋白印迹法检测，发现手术组的TGF-β1阳性表达条带明显宽于正常组和假手术组，而且其灰度值也明显升高。因此，笔者推断TGF-β1可能促使了大鼠胆管组织纤维化的发生，如果能够干预TGF-β1的表达则可能缓解胆管纤维化，进而改善胆管狭窄。目前研究发现，在增生修复的瘢痕组织中，Hic-5激活了TGF-βl，并促进了组织的瘢痕修复过程。当Hic-5被敲除或沉默后，TGF-βl的表达和分泌就会显著的降低［16-17］。但对于胆管组织，目前尚无Hic-5基因的相关研究，因此，能够明确Hic-5基因在胆管组织纤维化疾病中的作用机制对进一步的了解胆管纤维化的发生发展过程具有重要的价值和意义。本研究发现在胆管组织明显纤维化的手术组中，Hic-5的免疫组化阳性表达显著升高，主要分布于胆管细胞周围，同时蛋白印迹法也显示出手术组胆管组织的Hic-5蛋白表达量明显高于正常组和假手术组。此外，对免疫组化和蛋白印迹法的检测结果进行Pearson法相关性分析发现，Hic-5和TGF-βl存在明显的正相关关系，说明在纤维化的胆管组织中，两者可能存在某种互相调控关系，共同导致了胆管纤维化的发现。但本研究缺乏对Hic-5和TGF-βl的增强或者沉默来进一步的验证该结果，这也将是下一步进行的研究。

综上所述，本研究发现，在纤维化的胆管组织中，Hic-5和TGF-βl的表达均显著升高，胆管纤维化的发生与Hic-5和TGF-βl有着密切的关系。与此同时，Hic-5和TGF-βl在纤维化的胆管组织中呈正相关关系，说明两者可能共同促进了胆管纤维化的发生。笔者的发现对进一步明确胆管纤维化的发生发展机制奠定了基础，为从根本上改善各种原因所致的胆管狭窄提供了新的研究方向。