内质网应激对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

张强 徐亮

西南医科大学附属医院胃肠外科（四川泸州 646000）

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，占恶性肿瘤发生率的第4位，预后较差，其病死率高居世界第2位［1］。中国胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和病死的42.6%和45.0%，在全球183个国家中发病率位于第5位、死亡率第6位［2］。目前公认的幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP）感染是引起胃癌重要危险因素之一［3］。世界卫生组织国际癌症研究机构已将HP纳入第一类致癌原［4］。近年来研究发现，内质网应激在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用［5］，但具体作用机制尚不完全清楚。本文探讨内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料二氧化碳孵箱购买于日本三洋公司；酶标仪购买于美国Thermo公司；电泳仪、电泳槽和转移电泳槽购买于Bio-Rad公司；流式细胞仪购买于英国CytoFLEX公司；胃癌SGC-7901细胞是由西南医科大学医学实验中心提供；培养基（RMPI 1640）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、澳洲胎牛血清（FBS）及胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；抗体蛋白免疫球蛋白结合蛋白（BiP）、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、凋亡蛋白（Caspase-3）及内参（β-actin）购自美国Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）配制试剂盒、BSA封闭液、山羊抗鼠、山羊抗兔、硝酸纤维素膜（PVDF）发光试剂盒（BeyoECL Plus）、MTT试剂盒购于碧云天生物技术公司；衣霉素（tunicamycin，TM）及4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）购于美国Sigma公司；FITC Annexin V凋亡试剂盒购买于BD公司。

1.2 细胞培养及分组细胞的完全培养基中加入浓度为10%胎牛血清和1%的双抗，并培养于37℃、5%CO2孵箱中，每隔1～2 d换液一次，培养至细胞密度为80%左右进行传代。根据细胞不同处理条件，将对数期生长的细胞采用随机分组法分为3组：对照组（Control）、内质网应激组（ERS）、抑制剂组（4-PBA）。对照组采用完全培养基培养；内质网应激组给以3.5 μmol/L衣霉素处理24 h；抑制剂组给以100 nmol/L的4-苯基丁酸处理24 h。

1.3 MTT法检测各组细胞的活性经过不同处理后的细胞，每瓶加入2 mL MTT液，37℃避光孵育4 h，弃去液体，各瓶加入2 mL二甲基亚砜振荡15 min。每组细胞在96孔板上均设置5个复孔，每孔分别吸取200 μL细胞悬液，用酶标仪检测其在490 nm波长下的吸光度值。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡各组处理后的细胞，用胰蛋白酶消化各组细胞2 min，温柔吹打下细胞，使细胞悬浮，1 000 r/min（r=25 cm）离心5 min，用预冷的PBS洗涤3次，重悬细胞计数至5×106/mL，取100 μL细胞悬液于5 mL试管中，加入5 μL FITC及5 μL PI，25 ℃条件下避光孵育15 min，加入1×缓冲液400 μL，1 h内上机进行流式细胞学检测，每组重复检测3次。

1.5 Western blot法检测Bip、CHOP和Caspase-3蛋白的表达量处理后的细胞，吸尽细胞培养液，用预冷的PBS液洗涤细胞3次，吸尽PBS后，每组中加入含1%PMSF酶抑制剂及1%磷酸酶抑制剂的强RIPA细胞裂解液约600 μL，于冰上裂解30 min后，用细胞刮瓷刮下细胞，并转移至1.5 mL离心管中，超声震荡使细胞核破裂（5次，5 s/次），4℃离心（20 000 r/min，r=4 cm，15 min）去除沉淀后，用BCA测定蛋白浓度，配平蛋白浓度，加5×上样缓冲液煮沸（100℃15 min），取相同质量的蛋白上样，于SDS-PAGE凝胶电泳；转移至PVDF，5%的BSA常温下封闭1 h，TBST洗膜3次（每次5 min），一抗（1∶1 000）4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，TBST洗膜3次后，曝光显影。利用图像分析软件Fusion对条带进行灰度值定量分析，用“目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值之比”代表靶蛋白的量，重复3次实验。

1.6 统计学方法实验结果采用SPSS 17.0统计软件包处理数据，所有数据采用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准P=0.05。

2 结果

2.1 各组细胞的活性情况与对照组比较，内质网应激组胃癌SGC-7901细胞吸光度值明显降低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01），与抑制剂组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；而与对照组比较，抑制剂组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组细胞的活性图Fig.1 The proliferation of cells

2.2 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率与对照组比较，内质网应激组胃癌SGC-7901细胞凋亡率明显增加，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01），与抑制剂组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。而与对照组比较，抑制剂组差异无统计学意义（P ＞0.05），见图2。

2.3 各组细胞中Bip、CHOP及Caspase-3蛋白的表达量与对照组比较，内质网应激组SGC-7901细胞Bip、CHOP及Caspase-3蛋白表达量上调（增加倍），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），与抑制剂组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。而与对照组比较，抑制剂组差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图2 各组细胞凋亡检测结果Fig.2 The percentage of cell apoptosis

图3 各组细胞中Bip、CHOP及Caspase-3蛋白表达结果Fig.3 The expression levels of Bip，CHOP and Caspase-3

3 讨论

目前胃癌的主要治疗方式采用以尽早的手术干预为主及辅助放化疗的综合治疗，可显著增加胃癌患者的生存率。但在我国大多数诊断的胃癌患者已为中、晚期胃癌，失去绝佳的手术机会，导致预后较差，病死率较高［6］。内质网是真核细胞的细胞器，参与重要的生理功能，如蛋白质的加工厂，多种病理生理因素可破坏内质网稳态，引发蛋白质合成障碍，而错误折叠和未折叠的蛋白质在内质网腔内堆积，细胞为此将做出一系列的应激反应，即发生ERS反应［7］，若ERS反应较重，则凋亡信号通路会被激活，引起细胞凋亡。

内质网应激在许多肿瘤细胞中普遍存在［8］；BIP是一种分子伴侣，是由内质网合成及分泌的蛋白，正常情况下分泌较少，当发生内质网应激时，大量分泌，BIP高表达常被用作检测ERS存在的标准［9］。BIP可识别错误折叠蛋白，协助蛋白质的折叠、组装、延伸和转运、帮助未折叠蛋白质位于内质网腔，防止未折叠或错误折叠蛋白质的输出，保护细胞［10］。近年研究发现［11］，内质网应激可能在肿瘤细胞的生长、侵袭、转移中均发挥重要作用。人体胃癌组织中，内质网陪伴分子GRP78和GRP79高表达，且与肿瘤大小、侵袭深度和淋巴结转移等相关［12］。CHOP是内质网应激另一个特异转录性因子，属C/EBP转录因子家族成员，当ERS时，CHOP的表达量大大增加并聚集在细胞核内，CHOP过量表达能使细胞凋亡；CHOP还可影响Bcl-2家族蛋白的表达，能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达［13］，提高线粒体对促凋亡因素的敏感性。Caspase蛋白属半胱天冬酶家族，是ERS凋亡途径中特异性凋亡介质，在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化，只能被ERS激活并能介导线粒体非依赖性的细胞凋亡［14-15］。

本研究发现，SGC-7901细胞经过3.5 μmol/L浓度的衣霉素处理24 h后，与对照组比较，MTT实验示细胞的吸光度值（OD值）降低；流式细胞学示细胞的凋亡率增加；Western blot法示BiP、CHOP和Caspase-3蛋白的表达明显上调；而与对照组比较，内质网抑制剂组无明显变化；揭示了衣霉素诱导SGC-7901细胞发生内质网应激，经过内质网应激后可引起细胞凋亡。通过内质网应激可使肿瘤细胞呈程序性的死亡，抑制肿瘤的发生发展，可对肿瘤的治疗和预防在内质网应激层面提出新思路。

综上所述，衣霉素可诱导胃癌SGC-7901细胞内质网应激并上调Caspase-3蛋白表达水平，引起胃癌细胞凋亡；然而，参与内质网应激过程的机制十分复杂，有待于进一步研究。