手足口病信号转导和激活转录因子3表达研究*

李露怡，严跃文，李娟，邓长柏

（1.广州医科大学附属第五医院 儿科，广东 广州 510700；2.中能建电力医院 儿科，广东 广州 510500）

手足口病（hand-food-and-mouth disease,HFMD）是儿科常见的传染病，多见于5岁以下小儿，表现为手足臀部疱疹、口腔溃疡和发热等，可由多种病毒感染所致，大部分为普 通型病例，少数为EV71型病毒感染所致重型病例，合并神经源性肺水肿、脑炎和心肌炎等，死亡率高，近年有爆发流行的报道。HFMD发病机制不清，本文通过检测患儿外周血细胞因子及其信号转导和转录激活因子3（signal transduction and activation of transcription 3,STAT3）和磷酸化的STAT3（P-STAT3）蛋白，探讨其发病机制，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

59例HFMD患儿，均是门诊初次就诊患者，男33例，女26例；年龄1～8岁，按照卫生部制定手足口病（2010年版）诊断标准入选，均为普通型病例。此外，在儿童保健科门诊体检收集30例健康小儿（同年龄、性别，具有可比性）外周血标本，作为对照组，分别检测其细胞因子和外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中STAT3、P-STAT3蛋白表达。

1.2 实验方法

1.2.1 相关试剂、仪器及来源 PBS冲洗液、细胞裂解液［1 M Tris-CI（pH 7.4）5 ml，0.5 M EDTA 2 ml，NaCl 0.876 g、NaN30.02 g，Triton-x 100 ml，加ddH2O至100 ml即可用］均购于武汉晶赛生物工程公司；白介素-6、10、17等单克隆抗体试剂盒全部购于美国eBioscience公司。抗STAT3和P-STAT3抗体（第一、二抗体分别是兔抗人和羊抗兔抗体）和Western blot试剂盒、ECL（化学发光增强试剂盒）全部购于eBioscience公司，美国真空转膜印迹系统、BioRad-Jeldoc2000图像分析系统等仪器。

1.2.2 标本上清液和外周血PBMC制备 抽取患儿静脉血5 ml，加入肝素抗凝管中，加入红细胞裂解液，离心分离（每分钟3 000转）10 min，取上清液储存冻存于-80℃冰箱中用于细胞因子检测；下部分用PBS缓冲液冲洗，制备PBMC。

1.2.3 PBMC中STAT3和P-STAT3蛋白提取 在PBMC中加入细胞裂解液100 µl，超声粉碎，12 000 rpm、4℃离心20 min，取上清液测浓度，-20℃～-70℃冻存。

1.2.4 ELISA实验方法检测和质量控制 检测细胞因子（IL-6、IL-10、IL-17）：酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）具体操作步骤按试剂盒说明进行，即取用存储的血标本，加入一抗和生物素标记的二抗、温育、洗涕和显色，比色结果。为得到准确的结果，进行质量控制。首先保证各批标本合格，如标本存储时间少于6 个月，实验操作准确，再次进行预实验检测，取得质控血清和曲线图，并采用即刻质控统计学方法：如在相同实验条件下，多次（20次以上）检测，结果取均值加减2个标准差（x±2 s）为可靠值，大于95%值或小于5%值去掉。

1.2.5 Western blot检测STAT3和P-STAT3蛋白表达 取上述冻存的蛋白提取液50 µg，加等体积样品缓冲液经变性后点样、电泳及显影等步骤检测（见分子生物学操作手册和试剂盒说明进行），用β-actin做对照带，检测其对比光密度，先制定A590值标准曲线，再取100 µl，测量A590值，根据标准曲线得出样本蛋白质含量。抗TAT3和P-STAT3抗体（第一、二抗体分别是兔抗人和羊抗兔抗体）和Western blot试剂盒全部购于eBioscience公司。

1.3 统计学方法

用SPSS 16.0统计软件包分析。计量资料以均数±标准差（）表示，两组样本均数比较采用t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3结 果

59例HFMD患儿急性期血中白介素均升高，与健康对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1。

2.2 HFMD患者外周血单核细胞中STAT3和P-STAT3（Western blot）

59例HFMD患儿P-STAT3蛋白表达明显增强，较对照组明显升高，两者比较差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1。具体表达图（Western blot）见图1和图2。

表1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3结果 （）

表1 HFMD患者白介素、STAT3和P-STAT3结果 （）

组别 例数 IL-6/(pg/L) IL-10/(pg/L) IL-17/(pg/L) STAT3 P-STAT3 HFMD 59 40±6.2 54±8.5 33±4.4 126.60±2.67 72.31±2.46对照组 30 17±5.5 23±3.4 19±4.2 125.90±3.70 0.00±0.000 t值 17.577 19.260 14.274 0.92 225.00 P值 0.001 0.001 0.001 0.324 0.001

图1 STAT3和P-STAT3蛋白表达（Western）

图2 STAT3和P-STAT3蛋白表达（Western blot）

3 讨论

手足口病是小儿常见的急性传染病，好发于4～7月份和10～11月份，与气温变化有关[1-2]；近年来有爆发流行的报告，部分病例可出现并发症如脑炎、肺水肿等[3]。自从1957年加拿大首次报告以来，该病一直在全世界发生；研究表明，多种肠道病毒如科萨奇病毒、EV71病毒等均可导致HFMD[4]，虽然经过几十年的研究，但其发病机制尚未完全清楚，值得进一步研究。

细胞信号转导与转录激活因子（STAT）是细胞因子在细胞内重要的信息传递分子（蛋白家族），其激活（磷酸化）后使细胞核基因激活和表达，产生效应[5]。研究表明STAT3是IL-6在细胞内的重要的信息传递分子，在感染、肿瘤、缺氧损害和免疫等疾病发挥重要的作用[6-9]。

手足口病临床表现为发热、手足部出现疱疹，其本质是炎症反应的结果。在笔者的前期研究中发现，手足口病患者血中前炎症介质（白介素-6、白介素-10、白介素-17、白介素-21）和Th17淋巴细胞等明显升高，促进疾病的发生发展[10]。目前在国内尚未见有HFMD患者白介素-6信号转导及转录因子3（STAT3）变化的报道；据此本文进行了研究，结果发现在HFMD组患者IL-6信号通路激活，即磷酸化的STAT3表达增加（72.31±2.46），而总的STAT3没有增加（HFMD组和健康对照组分别是（126.60±2.67）和（125.90±3.70），两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），磷酸化的STAT3在HFMD组中升高，和健康小儿组比较差异有统计学意义（P ＜0.05），说明细胞因子信号通路激活在HFMD发生中起重要的作用，病毒感染和STAT3变化的关系值得进一步研究。国内王艳等[11]在实验研究中发现：EV71病毒感染横纹肌肉瘤细胞，下调STAT3和P-STAT3，STAT3可影响多种病毒的复制；Hill等[12]报道，STAT3具有抑制EB病毒对B淋巴细胞溶解的作用；Read等[13]研究报道，病毒感染通过MAPK.NFKB和STAT3信号通路促进细胞癌变和发展；而丙型肝炎病毒感染通过STAT3途径导致肝脏损害[14]。因此，STAT3在病毒感染所致的疾病发生发展中起到双刃剑的作用。本研究证实手足口病的发生发展也通过STAT3途径，其信号通路激活可能促进外周血有核细胞分泌更多的细胞因子，促进HFMD的发生，STAT3有可能成为治疗靶标，具有一定的临床意义。 因此，STAT3与HFMD的关系值得进一步研究。