TiO2修饰磁性石墨烯-通过型固相萃取净化人血中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素

何世伟， 赵永纲，2， 朱 岩*

(1．浙江大学化学系，浙江杭州310027;2．宁波市疾病预防控制中心，浙江宁波315010)

氯霉素是一种高效、广谱抗生素，可有效抑制细菌蛋白质的形成，它能有效地渗入脑脊液中，对于治疗多种细菌性脑膜炎有相当疗效［1］。然而，氯霉素对造血系统的毒性颇为严重，可引起人粒细胞缺乏病再生障碍性贫血和溶血性贫血［2－6］。将氯霉素分子中的对位硝基用甲磺酰基取代即为甲砜霉素，其抗菌谱和应用范围与氯霉素基本相同，但毒性降低。氟甲砜霉素是甲砜霉素的衍生物，也具有氯霉素的再生障碍性贫血等毒副作用。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的化学性质都极为稳定，在人体内容易产生药物残留。因此，建立一种监测血液中残留氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的高灵敏度、高选择性检测方法可以指导临床用药，增强疗效的同时有效避免和减少毒副反应。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的检测方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)与液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)［7－12］。其中，LC-MS/MS 法具有通量大、选择性高与灵敏度高等优势，更适于复杂基质中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的定性与定量分析。S＇niegocki等［7］采用 LC-MS/MS 方法实现了对鸡蛋、奶酪、牛奶、香肠等20多种动物源性食品中残留氯霉素的测定。然而，LC-MS/MS方法的精密度与准确度容易受到基质效应的干扰［13，14］，对于血液样品而言，其中的磷酯类物质是干扰LC-MS/MS方法精密度与准确度的主要来源［15－17］。目前，氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的前处理方法主要包括液液萃取与固相萃取，然而，液液萃取分析时间长，且溶剂消耗量大;固相萃取大多采用先吸附目标物再洗脱的策略，需要溶剂替换，且操作步骤相对繁琐。

2015年，美国沃特世公司开发了一种用于去除样品中磷脂与蛋白质等基质的Oasis PRiME HLB通过型固相萃取柱，该前处理方法快速、高效，可有效降低磷酯类物质对LC-MS/MS方法造成的基质效应。近年来，在Oasis PRiME HLB通过型固相萃取柱的基础上，诸多新型的吸附填料，如磁性羧基化石墨烯(Mag-CG)［16］、磁性羧基化碳纳米管(Mag-CCNTs)［16］以及 TiO2修饰石墨烯［18］等被开发出来，并作为PRiME通过型固相萃取柱填料用于去除血液样品中磷脂类物质的干扰。

本文在对多种固相萃取方法系统研究的基础上，采用PRiME通过型固相萃取方法净化血液样品中残留的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，并采用自制的TiO2修饰磁性石墨烯作为PRiME通过型固相萃取柱填料用于去除血液样品中磷脂类物质的干扰，有效克服了LC-MS/MS分析过程中基质效应对目标化合物定量影响。采用TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定血液中残留氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的方法尚未见报道。本文将快速、高通量的PRiME通过型固相萃取净化、超快速的液相色谱分离和高灵敏、高选择性的电喷雾串联四极杆质谱多反应监测(MRM)模式有机地结合起来，实现了对血液中残留痕量氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的测定。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂与材料

Prominence UFLC XR型超快速高分离液相色谱仪配有LC-20AD输液泵、SIL-20AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱和DGU-20A3脱气机(日本岛津株式会社);API 5500型三重四极杆串联质谱仪(美国AB SCIEX公司)和Analyst 1.5.1数据处理系统;Legend RT型离心机(德国Heraeus公司);全玻璃溶剂过滤器(美国Waters公司)。

乙腈为HPLC级(德国Merck公司)，所有的溶剂使用前均使用0.22 μm滤膜过滤。超纯水(18.2 MΩ·cm)，氯霉素(纯度大于98.0%)、甲砜霉素(纯度大于 98.0%)、氟甲砜霉素(纯度大于98.0%)、氯霉素-D5(纯度大于98.0%)标准品购自德国Dr．Ehrenstorfer公司，血液样品采集于宁波市第二医院。Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)与Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)购自美国Waters公司。TiO2修饰磁性石墨烯材料与TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱为实验室自制，其制备方法见文献［18］。本文所制备的TiO2修饰磁性石墨烯材料由厚度为30 nm的花瓣形纳米薄片有序堆叠而成，其透射电子显微镜图谱如图1所示。

图1 TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱净化血液样品Fig．1 Nano-titania-coated modified magnetic graphene oxide(TiO2-Mag-GO)PRiME pass-through cleanup for the human blood sample

1．2 标准溶液的配制

标准储备液:准确称取氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素-D5各10.0 mg于4个10.0 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1.0 g/L的标准储备液。

混合标准溶液:准确移取浓度为1.0 g/L的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准储备液各10 μL于10.0 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成1.0 mg/L的混合标准溶液。同法制得1.0 mg/L的氯霉素-D5标准溶液。

1．3 样品前处理方法

1．3．1 样品提取

准确移取100 μL全血样品于5.0 mL刻度离心管中，加入100.0 μg/L氯霉素-D5内标溶液4.0 μL，以乙腈定容至2.0 mL，涡旋5.0 min后，12 000 r/min离心5 min，上清液转移至另一支5.0 mL刻度离心管中。

1．3．2 样品净化

上清液全量转移至TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱，流速0.5 mL/min，收集1.0 mL流出液，N2吹至近干，以初始流动相溶解残渣并定容至 100 μL，过 0.2 μm 微孔滤膜，进样测定。样品净化示意图如图1所示。

1．4 色谱质谱条件

1．4．1 色谱条件

Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);进样量:10.0 μL;柱温:40 ℃;流动相:含0.08%(v/v)氨水水溶液(A)和含0.08%(v/v)氨水的乙腈溶液(B)。梯度洗脱程序:0～1.00 min，30.0%B～90%B;1.00～3.00 min，90.0%B;3.01～5.00 min，30.0%B。

1．4．2 质谱条件

离子源:电喷雾离子源;扫描方式:负离子扫描;定量检测方式:多反应监测模式;电喷雾电压(IS):－4 500 V;雾化气压力(GS1):340 kPa;辅助气压力(GS2):340 kPa;气帘气压力(CUR):276 kPa;碰撞气压力(CAD):41 kPa;离子源温度(TEM):500℃;扫描时间:50 ms;碰撞室出口电压(CXP):－10.0 V;碰撞室入口电压(EP):－10.0 V;定性离子对、定量离子对、碰撞气能量(CE)及去簇电压(DP)见表1。

1．4．3 定性及定量

3种目标化合物采用保留时间结合串联质谱三离子定性原则进行定性，以灵敏、稳定且无干扰的Q1/Q3离子对为定量离子对(见表1)，内标法定量。

2 结果与讨论

2．1 质谱条件的选择

在利用超快速液相色谱-三重四极杆质谱联用检测技术的过程中，为了获得最佳的质谱条件以保证对分析物定量和定性的准确性，必须对待测物的母离子、子离子、碰撞能量等质谱参数进行优化。

表1 目标物的定性定量离子对及去簇电压、碰撞能量与保留时间Table 1 Q1/Q3 ion pairs，declustering potential(DP)，collision energy(CE)and retention time of the analytes

本研究采用针泵进样的方式，首先采用前级离子扫描(Q1 Scan)方式获取待测物的母离子，之后采用子离子扫描方式(Q3 Scan)通过优化碰撞能量获得产物离子，最后采用多反应监测模式对待测物进行定性和定量分析。在上述优化的LC-MS/MS条件下，空白样品加标质量浓度为0.5 μg/L的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素MRM图谱如图2所示。

图2 空白加标样品(0.5 μg/L)的MRM色谱图Fig．2 MRM chromatograms of blank sample spiked at 0.5 μg/La．thiamphenicol;b．florfenicol;c．chloramphenicol．

2．2 提取溶剂对3种目标化合物回收率的影响

为了实现样品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的快速筛查和确证，本研究考察了提取溶剂对3种目标化合物回收率的影响。在固定其他实验条件的前提下，本文选取乙腈与乙酸乙酯作为提取溶剂，结果如图3所示。当采用乙腈作为提取溶剂时，甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率分别为92.2%、98.5%、99.2%;当采用乙酸乙酯作为提取溶剂时，3种目标化合物的回收率在122%～136%。这种现象可以解释为:乙酸乙酯在提取3种目标化合物的同时溶解了更多的脂溶性杂质，致使TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱达到饱和，进而无法有效消除样品提取液中的杂质，造成基质增强效应。鉴于此，本文采用乙腈作为提取溶剂。

图3 提取溶剂对甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素回收率的影响(n=3)Fig．3 Effect of extraction solvents on the recoveries of thiamphenicol，florfenicol and chloramphenicol(n=3)

2．3 固相萃取柱流速的优化

本文选择TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱作为样品净化方法，避免了传统SPE方法中对SPE小柱活化、淋洗与洗脱等步骤，进而缩短样品前处理时间。在保证目标物回收率的前提下，应在尽可能短的时间内完成血液样品中甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的提取与净化。因此，本文考察了TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱流速对目标物回收率的影响。结果表明:固相萃取柱流速对于甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率有显著影响。当其流速在0.1～0.6 mL/min之间时，回收率为89.2%～107%;然而，随着流速的增加，其回收率显著升高，当其流速在0.7～1.0 mL/min之间时，其回收率为129%～142%。这种现象可以解释为:随着流速的增加，样品提取液中的杂质无法保留在TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱中，进而无法有效消除样品提取液中的杂质所造成的基质增强效应。鉴于此，本文采用的固相萃取柱流速为0.5 mL/min。

2．4 TiO2修饰磁性石墨烯复合材料用量的优化

图4 TiO2修饰磁性石墨烯的用量对甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素回收率的影响(n=3)Fig．4 Effect of the usage amount of TiO2-Mag-GO composites on recoveries of thiamphenicol，florfenicol，and chloramphenicol(n=3)

本文采用自制的TiO2修饰磁性石墨烯作为PRiME通过型固相萃取柱的填料，以期在保证目标物回收率的同时，利用尽可能少的TiO2修饰磁性石墨烯有效地去除血液样品中磷脂等杂质。为了获得TiO2修饰磁性石墨烯的最佳用量，本文考察了TiO2修饰磁性石墨烯用量在40～200 mg范围内时，其对甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素回收率的影响，结果如图4所示。由图4可知，当TiO2修饰磁性石墨烯用量为40 mg时，甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率在126%～132%范围内。这一现象可以解释为:样品提取液中的杂质无法全部保留在TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱中，进而无法有效消除样品提取液中的杂质所造成的基质增强效应。随着TiO2修饰磁性石墨烯石墨烯用量的增加，样品提取液中的杂质所引起的基质增强效应逐渐减弱。当材料用量为100～200 mg时，甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的回收率稳定在91.0%～109%。综上所述，本文选取100 mg TiO2修饰磁性石墨烯为PRiME通过型固相萃取柱填料的最佳用量。此外，本文考察了市售Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)、Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)与TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱对3种目标分析物净化能力。实验结果表明:采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)处理血液加标样品，甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的回收率为129%～142%;采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)与TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱处理血液加标样品，目标分析物的回收率分别为89.2%～116%和91.0%～109%。由此可知，本文所制备的TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱与Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)对血液样品中甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的净化能力相当，具有广泛的应用前景。

2．5 基质效应

本文采用空白基质加标样品中目标物的峰面积与相应质量浓度的标准溶液峰面积之比［16］对血液中甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素在使用PRiME通过型固相萃取柱净化前后的基质效应进行评价，结果如表2所示。未经PRiME通过型固相萃取柱净化的血液加标样品，其基质增强效应较为显著(138%～195%);采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)处理血液加标样品，甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的基质效应为120%～140%;采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)与TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱处理血液加标样品，目标分析物的基质效应分别为92.2%～117%与89.6%～112%。本文所制备的TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱与Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL)可有效降低血液样品中基质对甲砜霉素、氟甲砜霉素、氯霉素的基质增强效应。

表2 血液中甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素在使用PRiME通过型固相萃取柱净化前后的绝对基质效应(n=6)Table 2 Absolute matrix effects of thiamphenicol，florfenicol，and chloramphenicol in human blood before and after PRiME pass-through cleanup procedure(n=6)

2．6 校正曲线、检出限、定量限、精密度与回收率

为了验证3种目标化合物的线性，配制了一系列甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素加标质量浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L 的混合标准溶液，以基质匹配内标法定量。每个浓度重复测定10次。实验结果表明，甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素在0.1～10.0 μg/L的范围具有良好的线性关系(决定系数 r2＞0.999)。

采用在空白血样中添加目标组分的方法，根据MRM色谱峰的3倍信噪比和10倍信噪比确定3种目标组分的最低检出限和定量限，甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的LOD与LOQ分别为0.017～0.025 μg/L与0.056～0.082 μg/L。以不含待测物的血液样品为空白，以甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的加标水平分别为0.16、1.6和8.0 μg/L的各10个平行样进行回收率和精密度考察，目标组分在3个不同水平的全血加标回收率分别为91.6%～102%、90.0%～105%和 91.2%～99.1%，相对标准偏差(RSD)为 2.7%～5.0%、3.8%～6.6%和 1.2%～5.4%(见表3)。

表3 空白人血样品中3个加标水平下的线性方程、回收率、精密度、检出限、定量限以及决定系数(n=10)Table 3 Linear equations，recoveries，precisions，LODs，LOQs and determination coefficients obtained for analytes at three spiked levels in blank human blood samples(n=10)

2．7 实际样品分析

应用本研究建立的检测全血中甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的方法，对采集的20份全血样品进行了检测。结果表明:所采集的20份样品中，有1份检测出氟甲砜霉素，其含量为3.10 μg/L，阳性样品的MRM色谱图如图5所示。

图5 阳性血液样品的MRM色谱图Fig．5 MRM chromatogram of a positive blood sample

3 结论

本文利用自制的TiO2修饰磁性石墨烯复合材料作为PRiME通过型固相萃取柱的填料，有效去除了全血样品中的脂肪酸、酸性磷脂等基体干扰物对甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的基体增强效应。建立的采用TiO2修饰磁性石墨烯-PRiME通过型固相萃取柱-LC-MS/MS在多反应监测模式下测定全血中甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的方法，具有快速、准确、灵敏的优点，其定量限在0.056～0.082 μg/L范围内，能较好地用于临床全血样品中痕量甲砜霉素、氟甲砜霉素与氯霉素的测定，可以有效指导临床用药，增强疗效的同时有效避免和减少毒副反应。