丹酚酸B对泡沫细胞内胆固醇代谢和ABCG1表达的影响

冯旭，许恩师

(锦州医科大学附属第一医院神经外科，辽宁 锦州 121001)

随着社会的不断发展，目前缺血性脑血管病已经成为危害人类健康最常见的一种疾病，其主要的病理基础为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的形成，目前大量的临床实验及研究证实，AS在血管壁形成的主要原因为，富含脂类的泡沫不断聚集而产生[1]。其中巨噬细胞源性泡沫细胞的形成原因是由于氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在细胞内的不断蓄积而产生[2]。

近年来，为了研究新型改善血脂类药物，人们将关注点集中在血浆脂蛋白代谢过程中的两个关键步骤中： 其一为ox-LDL参与的泡沫细胞的形成，其二为与高密度脂蛋白代谢密切相关的细胞中胆固醇逆向转运(RCT)的相关信号靶点。

丹酚酸B属于酚酸类化合物，作为丹参的重要药理学活性水溶性组成成分，被广泛认为具有抗氧化活性，包含预防LDL氧化作用以及对脂质过氧化的作用[3]。ATP 结合盒转运体G1(ABCG1 )目前已知的主要作用是促进细胞内胆固醇流出到成熟高密度脂蛋白粒子上，同时与其他转运载体相互作用，促进胆固醇逆转运。ABCG1的重要功能除了能移除体内过多含量的胆固醇，并且可以参与炎症抑制，因此ABCG1作为重要的靶点，用于抑制动脉粥样硬化发展的研究过程[4]。

现有的临床研究中，未发现丹酚酸B对巨噬细胞中ABCG1 mRNA表达的相关报道，此次实验拟通过观察丹酚酸B对人单核源性巨噬细胞泡沫化的影响，通过RT-PCR 检测ABCG1 mRNA的表达，从而将ABCG1这一重要靶点引入泡沫细胞内胆固醇代谢的研究中。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂及仪器

THP-1单核巨噬细胞株，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京协生细胞生物学研究所)，佛波酯(PMA)，RPMI-1640培养基，油红0(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(上海山进生物科技有限公司)，逆转录试剂盒，实时荧光定量RT-PCR试剂盒(瑞士Roche公司)；CO2培养箱(上海杰涵实验设备有限公司)，实时定量PCR 仪(ABI 公司)，丹酚酸B(中国药品生物制品检定所，纯度为97.2%)，其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 实验中泡沫细胞的培养及实验方法分组

首先将THP-1细胞放置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中，细胞的生活环境为10%的小牛血清、其中加入1×108U/L青霉素的RPMI-1640完全培养基。在每次实验开始前，首先分化THP-1细胞，方法为采用150 nmol/L佛波酯加入细胞培养基中24 h，此过程可以使THP-1细胞转化为巨噬细胞，之后加入ox-LDL，将浓度调整为100 mg/L时，泡沫细胞形态及活性良好。将实验细胞在每次实验开始时分别加在6孔培养板中，每孔的密度平均分配。先以100 μmol/L 丹酚酸B加入实验细胞中,分别在8、16、24 h收集细胞，提取每个实验组中的mRNA，根据检测结果选择16 h处理时间；再分别以不同浓度丹酚酸B加入巨噬细胞中，进行实验检测数据。每组设置5个重复，每次试验独立重复5次。

1.2.2 油红O对于泡沫细胞的染色和实验组脂质染色的半定量分析

细胞经上述方法处理后，用PBS将泡沫细胞反复冲冼，将其放置在4 ℃的环境中，加入10%的甲醛，放置10 min，固定细胞，用油红O方法进行细胞染色：水冼 5 min,放置在60%的异丙醇中5 min,放置在新鲜过滤的油红O中染色10 min 60%异丙醇分5 min，水冼5 min,采用明矾染液染色细胞5 min，分色及反蓝巨噬泡沫，水洗细胞5 min，然后进行照相比对。Wada方法[5]进行半定量分析细胞内脂类含量。如果被染色剂染成红色的细胞脂类成分面积小于细胞核的面积，可以将该类细胞标记为阴性细胞,相反，被染色剂染成红色的脂类成分面积等于或大于细胞核的面积则可以将这类细胞标记为阳性细胞。每个实验组孔随机计数一个视野(×400)的细胞。

1.2.3 高效液相色谱法分析细胞内脂类含量

参照peat J的实验方法，对于实验细胞组分的胆固醇含量进行高效液相色谱测定[6]，胆固醇数量值用外标法峰面积进行定性定量测定。C18为色谱柱，流动相：异丙醇∶正庚烷∶乙腈的比值设定为35∶12∶52，单位为v/v，采用非梯度洗脱；实验流速为1 mL/min；检测波长设定为210 nm，检测到第8分钟；柱温设定为20 ℃。使用已知的CE酶水解CE得到总胆固醇(TC)量,以TC-FC量代表胆固醇酯(CE)的量。

1.2.4 荧光实时定量(RT-PCR)

将实验组及对照组细胞处理完毕，按照说明书的方法提取RNA，使用电泳方法检测RNA的完整性，使用核酸蛋白检测仪检测测定RNA 溶液的浓度和纯度。公司预先设定好引物基因，使用两步法扩增mRNA，按公司提供的引物序列进行RT-PCR反应，扩增采用20 μL体系，每个样品设5 个重复。

1.2.5 统计学方法

2 结 果

2.1 细胞泡沫化模型的建立

将ox-LDL加入THP-1单核巨噬细胞24 min后,应用油红O染色半定量分析结果显示：正常对照组中，细胞中脂类无红染现象，在ox-LDL诱导组中,经油红O染色后，阳性细胞满布于视野中。使用半定量方法测定经过油红O处理的阳性细胞数量可以看出(表1)，阳性细胞比率由(8.35±1.20)%增加到(83.7±0.78)%，比例提高约10倍，说明此种方法处理的巨噬细胞泡沫化效果明显。

表1 不同浓度丹酚酸B处理16 h后油红O染色阳性细胞的相对含量

注：与对照组相比：#P<0.01；与ox-LDL组相比：■P<0.01

2.2 丹酚酸B处理泡沫细胞后，CE/TC值的量-效关系

应用不同浓度丹酚酸B处理泡沫细胞后，油红O染色阳性细胞的数量比例明显减少，当浓度在100 μmol/L时，阳性细胞比例接近正常细胞(表1)。HPLC检测结果显示，CE/TC值随着丹酚酸B浓度的增加而降低(表2，■P<0.01)，说明丹酚酸B处理泡沫细胞后减少胆固醇酯在细胞内聚集，有效抑制THP-1巨噬细胞泡沫化。

表2 不同浓度丹酚酸B处理16 h后细胞中

注：与对照组相比：#P<0.01；与ox-LDL组相比：■P<0.01

2.3 丹酚酸B对ABCG1 mRNA 表达的影响

前期实验确定16 h为ABCG1 mRNA 表达的最佳时间，将此时间设定为处理时间。选择不同浓度的丹酚酸B(详见实验组)干预泡沫化的THP-1 细胞16 h，可见ABCG1 mRNA 表达水平随丹酚酸B浓度增加而升高，其中100 μmol/L 丹酚酸B处理组为0 μmol/L 丹酚酸B的2.12倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

目前对于AS形成的研究中，有两种理论最为盛行。其中之一“损伤反应”理论认为，AS的形成过程中最开使发生的为血管内皮的损伤，内皮损伤后，单核细胞以及以LDL为主的循环脂蛋白顺着破损的内膜间隙开始迁移，这些作用导致单核细胞源巨噬细胞不断摄入修饰的LDL，最终导致巨噬细胞的泡沫化[7 -8]。另一种“滞留反应”理论认为，LDL首先迁移到内膜间隙，通过与蛋白多糖结合形成大分子，滞留在内膜间隙中并被修饰，接着被巨噬细胞摄取，进而引起巨噬细胞的泡沫化[9]。本实验在体外模拟泡沫细胞的形成过程，用ox-LDL处理巨噬细胞，当培养瓶2浓度调整100 mg/L时，巨噬细胞泡沫化最为高效，泡沫化率接近95%。

ABCG1 为跨膜蛋白，是ATP 结合盒转运体(ATP binding cassette transporter，ABC)超家族中的重要一员，ABCG1消耗ATP完成介导蛋白质、胆固醇、磷脂等多种物质的跨膜转运。有研究表明，ABCG1主要作用为使胆固醇流出到成熟的高密度脂蛋白粒子上，促进胆固醇的逆转运。在巨噬细胞中，ABCG1的表达可以防止脂质的过量累积，从而具有防止动脉粥样硬化的作用[10]。目前有关报道提出，巨噬细胞中的ABCG1通过多种机制促进细胞内的胆固醇转运至细胞外，还可以加强细胞内高密度脂蛋白的表达，对于细胞内的炎症反应及趋化作用起到积极的抑制作用，从而达到防止动脉粥样硬化的作用[11]。ABCG1 在细胞内的多种作用可以将炎症反应和脂类物质的代联系在一起。本研究显示，100 μmol/L 丹酚酸B处理THP-1 细胞16 h 显著增加了ABCG1 mRNA 的表达，使得丹酚酸B在 抑制AS 和炎症相关疾病的机制得以补充。

丹酚酸B作为重要的酚酸类化合物，为丹参的主要药理学活性组成成分，并具有良好的水溶性[12]。目前注射用丹参多酚酸盐已在临床上被广泛应用，尤其在治疗缺血性脑血管疾病的治疗中尤为重要，丹酚酸B镁盐在其中扮演重要角色[13]。本实验首先建立泡沫巨噬细胞模型，然后使用不同浓度的丹酚酸B对实验组泡沫细胞进行干预。实验结果显示，丹酚酸B处理泡沫细胞后，细胞内红染细胞成分及细胞内CE/TC值随着丹酚酸B浓度的增加而降低(P<0.01)，说明丹酚酸B可有效抑制巨噬细胞的泡沫化，促进胆固醇向细胞外流出。100 μmol/L 丹酚酸B处理泡沫细胞16 h后，显著增加了ABCG1 mRNA 的表达，提示这可能为丹酚酸B抗AS的一个新的作用机制，进一步丰富了丹酚酸B在抗动脉粥样硬化过程中的作用。综上所述，丹酚酸B的抗动脉粥样硬化作用除已知的调脂作用外，与其通过上调ABCG1表达，降低巨噬细胞摄取胆固醇，抑制巨噬细胞泡沫化有关。本研究的后续工作将从分子水平对丹酚酸B抗动脉粥样硬化和抑制细胞泡沫化的机制进行深入探讨。