鲤春病毒血症病毒的研究进展

2018-11-06林婧楠赵景壮卢彤岩徐黎明

水产学杂志 2018年5期

林婧楠，赵景壮，卢彤岩，徐黎明

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

鲤春病毒血症病毒属单股负链RNA病毒目，弹状病毒科Rhabdoriridae，暂定为水泡性病毒属Vesiculorius，被类脂囊膜包裹的弹状病毒[1]。鲤春病毒血症的潜伏期较短，没有典型的外部临床症状，容易误诊。目前尚无有效控制该病的方法，一旦出现疑似该病的症状，应及早确诊，隔离感染和带毒的病鱼，截断水平传播途径及捕杀来控制。

1 病原生物学特征

CSVV病毒粒子在15%～60%的蔗糖溶液中浮力密度为1.16g/mL[2,3]，在5%～25%的蔗糖梯度中沉降系数为38～40S[4]。外界环境的改变影响病毒的感染性，对酸（在pH3时30min，侵染率1%）、碱（在pH11时，侵染率50%～70%，pH7～10时最为稳定）、热（56℃，30min）、脂溶剂以及乙醚最为敏感，其他化学试剂，如2%NaOH、500mg/L含氯消毒剂、0.01%碘，在特定浓度和作用时间可使病毒失活，可用于养殖消毒。血清可以保护病毒的侵染力，实验室常用2%血清培养液保护病毒。含有血清时，经过4次反复冻融，侵染率在90%左右，而缺乏血清时，侵染率仅为5%左右。冷冻真空干燥可长期保存病毒[5]。

2 基因结构特征

CSVV粒子为典型的弹状结构，一端圆弧形，另一端平坦，长90～180nm，宽60～90nm[5-7]。其基因组全长为 11 019bp[8]，由非翻译前导（Leader）区、基因区、基因间连接区及非转录拖尾（Trailer）区4个主要部分构成（图1）。

基因前导区有69bp，前19bp可能为启动子，其中50～56bp（GAAAAAT）为前导RNA转录终止信号，60～64bp（AACAG）为N基因转录起始信号。

基因区共包含5个开放阅读框（ORFs），编码5种结构蛋白：核蛋白（Nuclear protein，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基质蛋白（Matrixprotein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）和 RNA 聚合酶（RNA polymerase，L），3’端到 5’端的排列顺序为 N-P-M-G-L。

核蛋白（N）在病毒粒子中含量最多，主要与RNA紧密结合构成直径约50nm、呈螺旋对称的核衣壳。该结构蛋白在转录调节中起重要的作用[6]。

磷蛋白（P）为核衣壳的组成部分，呈酸性，纯化后SVCV的P蛋白在SDS-PAGE中分子量约50kD，高于推算的结果（35.5kD），其原因可能是P蛋白N端（45～88）存在一个大的负电荷结构域[8]。

基质蛋白（M）由223个氨基酸组成，呈磷酸化、高度碱性，构成囊膜内表面。糖蛋白通过M蛋白与螺旋状核衣壳相连，共同实现病毒粒子的装配、出芽的启动功能。

糖蛋白（G）由509个氨基酸构成，病毒粒子的囊膜表面有长钉状的糖蛋白突起。成熟的糖蛋白为三聚体囊膜粒子，由3部分构成：胞外结构域、跨膜结构域和胞浆结构域，是典型的跨膜蛋白，能选择性地识别宿主细胞受体，促使二者的膜融合，介导病毒内吞，使宿主细胞感染致病；在免疫系统下，识别病原，诱导宿主产生中和抗体。糖蛋白含有与免疫相关的抗原决定簇，对血清学特征起决定性作用，是当前DNA疫苗设计研究的热点。2002年至2004年，刘荭等[9]从养殖的鲤科鱼类和观赏鱼中分离出8株CSVV，测定了其G蛋白编码的基因序列，发现我国的这8个分离株与USA株、980451株、980528株和970469株在系统发育树上的进化方向一致。根据Stone等[10]对各地分离出的部分CSVV的G蛋白基因序列以及Basic等[11]1994年至2007年收集的22株G蛋白部分核酸序列的分析和系统发育树比较，将CSVV的基因型分成Ia、Ib、Ic和Id 4个亚组，Ia和Id的变异度较高，又将有明显差别的3个Id基因组毒株划分为Id1、Id2及Id3。CSVV中的一个血清型能与狗鱼苗弹状病毒（Pike fry rhabdovirus,PFRV）产生交叉反应。前期研究发现，中国CSVV的分离株的基因型为Ia[12]。

RNA聚合酶（L）是核衣壳的组成成分，可与N、P蛋白共同组成病毒内核衣壳的RNA蛋白复合物，完成病毒的转录和复制。

图1 鲤春病毒血症病毒（carp spring virernia virus,CSVV）病毒结构、基因组结构以及连接顺序（引自http://viralzone.expasy.org/4657）Fig.1 Structure,genomic and linkage of carp spring virernia virus（CSVV）

在基因间连接区的G-L基因中存在4bp（CTAT）保守序列，其余基因间存在2bp（CT）保守序列[13]。该调控区存在于水泡病毒属中；G-L基因间不存在类似粒弹状病毒属编码的非结构蛋白（nonstructural protein，NVprotein）基因。该蛋白在病毒复制过程中起重要作用，这两点均为区分粒弹状病毒属和水泡性病毒属的重要标志。

拖尾区有49bp，其中TATG（A）7为L基因转录终止信号，末端的8个核苷酸序列（GTCTTCGT）与前导区末端（ACGAAGAC）呈反向互补，是弹状病毒基因组及不分段负链RNA病毒的共同特征[8]。

与同属的其他弹状病毒相比，CSVV的蛋白序列中L蛋白间的同一性最高，与VSV的L蛋白氨基酸序列同一性达53.6%[14]；与水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）的M蛋白同一性达28%，在羧基末端的同一性较低[15]。

3 分类特征

迄今已报道的鱼类弹状病毒（Fish rhabdovirus）有十几种，鲤春病毒血症病毒（CSVV）是其中的一种，此外还包括病毒性出血败血症病毒（Viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）、日本牙鲆弹状病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）、狗鱼苗弹状病毒、乌鳢弹状病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）、弹状病毒 903/87（Rhabdovirus 903/87,903/87）、鳜弹状病毒（Mandarin fish Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV）、胭脂鱼弹状病毒（Chinese sucker rhabdovirus，CSRV）及新近分离出的海鲑弹状病毒28/97（Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV28/97）等[16-19]。

弹状病毒科包括水泡性病毒属（Vesiculovirus）、狂犬病毒属（Lyssavirus）、暂时热病毒属（Ephemerovirus）和粒弹状病毒属（诺拉弹状病毒属，Novirhabdovirus）。其中粒弹状病毒属是国际病毒分类委员会第7次报告上设立的一个新属。根据是否含有编码非结构蛋白的基因，将传染性造血器官坏死病毒、病毒性出血败血症病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、鳢弹状病毒、牙鲆弹状病毒归为粒弹状病毒属。而鲤春病毒血症病毒和狗鱼苗弹状病毒暂定为水泡性病毒。

4 流行情况

鲤春病毒血症病毒感染的鱼类较为广泛，主要感染鲤科鱼类，如锦鲤Cyprinus carpio、草鱼Cten opharyngodm idellus、鲫 Carassius auratus、鲢 Hypophthalmichthys molitrix、鳙 Aristichthys nobilis、金鱼 Carassius auratus、拟鲤 Rutilus rutilus、圆腹雅罗鱼Leuciscus idus和丁鲷Tinca tinca等。此外，自然感染的鱼类还有六须鲇Silurus glanis[20]。一龄以上的鲤最易感染患病。在中世纪，该病在欧洲开始流行，对欧洲各国鲤科鱼类养殖业造成了巨大的经济损失[21]，而后向美洲和亚洲等地传播。我国于2003年首次在天津养殖场的观赏鱼中分离出SVCV[22]。目前，该病已成为全球性鱼类的疾病。

该病毒可在13～22℃下生长，最适为17℃。因此，SVC常在水温15～20℃的春季爆发，17℃左右发病率高，水温超过20℃有所下降，超过22℃不再发病。

染毒鱼、病鱼和病死鱼是主要的传染源，以水平传播为主，垂直传播次之。水平传播包括直接接触传播和间接传播，间接传播包括非生物媒介（水）；生物媒介（水生吸血寄生虫）以及污物传播。病毒随附着污物（粪便、尿液、皮肤黏液和性腺分泌液等）排出体外，4～10℃时水中和泥中仍具有感染性，可保持4～6周[5,23]，可通过鳃进入鱼体内，在血液中保持11周左右。

5 临床症状及病理变化

5.1 临床症状

行为变化：早期病鱼呼吸困难，需氧量高，常聚集在池塘进水口附近，食欲减退，行动迟缓，对应激的反应迟钝，身体平衡力降低；后期病鱼萎靡，身体倾斜，常卧于池底[21,24]，严重时停止游动。

临床症状：病鱼体表发黑、眼球突起、鳃丝苍白、皮肤表面和肌肉有出血点、腹部肿胀、内有积水，肛门处拖有一细长、黏稠、粪便样的肠黏膜炎症产物与排泄物的混合产物，常称之为“假粪”，但不属于该病的特征性症状。

5.2 病理变化

染毒鱼最终因体内水盐平衡失调致死。剖检病鱼发现，主要以全身性出血、水肿为主要特征症状。病毒通常在毛细血管内皮细胞、造血组织和肾元细胞等部位增殖。在感染期，肝、肾、脾、鳃、脑髓病毒含量较高，常作为检验组织，发病3周后，含量迅速下降消失。血液中病毒滴度不高，但持续时间长。肝脏实质组织出现多个病灶坏死、充血，可见黄疸现象；胰脏组织出现炎症以及大量坏死病灶；脾脏充血，网状内皮大量增生；肠道严重发炎，出现卡他性肠炎。

6 检测技术

CSVV病毒可在鲤上皮瘤细胞（EPC）、草鱼性腺细胞（CO）、鳙尾柄细胞株（FHM）、蓝鳃太阳鱼成纤维细胞（Lepomis macrochirus，BF-2）和虹鳟性腺细胞（RTG-2）等鱼类细胞株上增殖，造成细胞病变效应（Cytopathogenic effect，CPE）。病变细胞内出现颗粒，H＆E染色可见胞质萎缩空泡化，核膜增厚，显微镜下可见脱落的细胞变亮[20]。FHM和EPC细胞最敏感，为OIE推荐的分离病毒的细胞。EPC和FHM的最适温度为20～25℃和20～22℃，产生的最大感染性为109TCID50/mL。该病毒除了在鱼类细胞中增殖，还能在禽类、哺乳类和两栖类动物细胞内增殖。

6.1 传统的检测方法及免疫学方法

目前，国内外常采用细胞培养法分离、检测CSVV病毒，再通过中和试验确定。该方法虽然准确率高，但检测大约需要2周左右，耗时费力。

在细胞培养分离病毒的基础上，可采用免疫学的方法，如酶联免疫吸附检验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）进行鉴定、间接荧光抗体试验（Indirect fluorescent antibody test，IFAT），但CSVV的囊膜来自宿主的细胞膜，易产生非特异性的抗体，因而病毒的抗血清效价不高，影响检测结果[25]。CSVV在血清学上区别于其他弹状病毒，采用ELISA可能会与其他鱼类弹状病毒如VHSV、IHNV等发生交叉反应，还与PFRV有共同的抗原决定簇，在ELISA和间接荧光（IF）中有明显的交叉反应[26,27]。高隆英等[26]根据CSVV糖蛋白基因序列设计逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和半嵌套PCR（semi-nested-PCR）的引物 F1、R2、R4，其中 F1和R2可扩增出CSVV核酸中的714bp片段，F1和R4可扩增出606bp片段。特异性检测结果表明，与VHSV、IHNV和PFRV无交叉反应，具有良好的特异性，可在42h内得到结果。

6.2 OIE检测标准

根据OIE公布的《水产动物检测手册》，目前我国出入境检验检疫行业标准SN/T1152-2002以及我国规定的GB/T 15805.5-2008鱼类检疫方法，常规检测CSVV方法是通过细胞培养分离病毒后，采用RT-PCR方法进行诊断。该过程需经过两代的细胞培养，时间长，检测效率低。王姝等[28]在国家行业标准的基础上，有机结合细胞培养法，利用酶联免疫吸附试验ELISA进行初步的筛选，再用RT-PCR复查，即实现高通量检测，整个用时又比国家标准用时缩短了一半。

6.3 核酸探针检测方法

Svetlana F等[29]根据CSVV-S30株的M和G基因的核酸序列设计引物，构建生物素标记的核酸探针，应用RT-PCR和斑点杂交技术成功在感染CSVV的细胞培养液和鱼组织中检测出病原体，其中在脑组织中最易检测出该病毒。利用生物素标记的核酸探针方法，既实现了快速检测，又提高了其灵敏度。

6.4 荧光RT-PCR检测方法

张利峰等[30]根据鲤春病毒血症病毒的核酸保守区序列，建立了快速检测CSVV的荧光RT-PCR检测技术，仅需4h就可以检测出10-6病毒稀释液，不仅试验周期短、灵敏，还实现了对病毒模版RNA的定量。安伟等[31]根据CSVV的核蛋白的保守序列，成功建立了SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测技术，病毒检测下限100.76TCID50/mL，灵敏度高于常规PCR 100倍。

6.5 数字RT-PCR检测方法

吴斌等[32]利用“油包水”的形式，对RT-PCR的扩增反应进行计数，建立了数字RT-PCR的技术。与实时定量RT-PCR相比，在两者均能检测病毒的104稀释倍数基础上，拥有更高的灵敏度。

6.6 间接ELISA检测方法

郭闯等[33]以超速离心法纯化CSVV，免疫大白兔，制备了兔抗CSVV免疫血清，同时利用间接ELISA方法快速检测CSVV，以兔抗SVCV血清1∶300稀释后包被96孔酶标板，滴度筛查CSVV阳性毒株，结果与RT-PCR鉴定结果相同。整个过程需要1 d，具有周期短、准确的优点。

6.7 新型液相芯片检测技术

尹伟力等[34]根据GenBank中CSVV的G基因序列，找出25对保守碱基作为检测探针，设计引物并进行生物素标记，通过液相芯片仪器检测偶联荧光编码微球与CSVV的RT-PCR产物杂交反应产生的荧光信号，发现液相芯片检测体系在鉴别CSVV上具有高特异性和灵敏度，最低检出量为10 pg。

6.8 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）

Shivappa等[35]对美国卡罗莱纳州分离的CSVV菌株的G蛋白基因序列，设计出4套引物，分别进行LAMP和RT-LAMP扩增，证实建立的RT-LAMP对CSVV的检测具有特异性，与RT-PCR的灵敏度相似，最低检测量达101TCID50/mL。

陈进会等[36]依照G基因保守序列，设计3套LAMP引物，通过恒温实时荧光检测系统ESE-Quant tube scanner，第1套和第3套有峰值，进而引入环引物。结果显示，第1套LAMP引物的检测稳定性、灵敏度和特异性效果最佳，能够实现高效检测CSVV。因此，实时荧光LAMP法具有极佳的灵敏度和快速检验的优势，适用于基层检验，检测限度可达到每反应2.4 pg。

7 防治方法

目前对于该病没有特效药和有效的控制方法，只能通过化学、物理消毒的方式预防该病。一旦发现该病，应及时中断传染源，隔离或扑杀病鱼和带毒鱼，防止大规模疫病的爆发[31]。在20世纪80年代，欧洲出现了含CSVV和PFRV的二阶灭活疫苗，能够诱导鲤科鱼类产生高效的中和抗体。随后，成功开发了CSVV弱毒疫苗，在养殖渔业中有良好的应用前景。给体质量40～100g的鲤腹腔注射6.3×104TCID50后，免疫保护率在90%以上[37]。我国的CSVV疫苗研制还处于探索阶段，主要的研究领域集中在减毒疫苗、亚单位疫苗及核酸疫苗等。

传统灭活疫苗、减毒疫苗具有毒力返强的缺点[25]，需要添加佐剂，存在一定的安全隐患，应用效果不稳定。

DNA疫苗是90年代的最新一代疫苗，无需像传统的灭活疫苗添加佐剂，却仍具备传统疫苗的优点。DNA疫苗构型更接近天然构象，潜在致病性低，适于工厂化集中生产，相对安全，具有一定的应用价值[38]。CSVV疫苗的研发有一定的进展，Kanellos等[39]以CSVV G蛋白基因，设计了构建稳定性较好的DNA疫苗。为评估已构建的4组CSVV糖蛋白DNA疫苗的免疫效果，欧阳征亮等[40]通过肌肉注射的免疫途径诱导机体产生免疫。结果显示：第一组重组质粒DNA编码全长的G蛋白疫苗保护率为14.47%；第二组重组质粒DNA编码去C端信号肽的G蛋白疫苗保护率为22.22%；第三组重组质粒DNA编码去N端跨膜区的G蛋白疫苗保护率为17.32%；重组质粒DNA编码同时去C端信号肽和N端跨膜区的G蛋白疫苗保护率为17.32%。Emmenegger等[41]的鲤攻毒试验验证，已构建的CSVV的G蛋白DNA疫苗的保护效率为50%～88%，能够有效降低感染鲤的死亡率。