UPLC-MS/MS法测定人血浆中金刚烷胺的含量
2018-11-02江峰
江峰
帕金森病（Parkinson disease，PD），是中老年常见的运动障碍疾病，目前以药物治疗最为有效[1]。中国帕金森指南将金刚烷胺作为首选治疗以震颤为主及年龄〈65岁的早期PD患者[2]。结合国情，金刚烷胺作为治疗PD基药[3]纳入国家医保甲类目录[4]。然其治疗窗窄，过量致昏迷、死亡[5]，肾功能障碍者易蓄积中毒[6]，故应开展临床用药监测。有文献报道采用LC-MS法，但存在局限性，如检测时间长（≥6.5 min）、灵敏度低、样本处理过程复杂、血浆用量较大等[7-10]。本实验建立一种快速、灵敏、操作简便的UPLC-MS/MS法，旨在为临床开展治疗药物监测和药动学探究提供方法学基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters Acquity H-Class超高效液相色谱仪、Xevo TQD三重四级杆质谱仪、MassLynx数据处理系统（美国Waters公司）；Vortex-Genie 3多功能旋涡混合器（美国Scientific Industries公司）；HSC-12A恒温槽（天津恒奥科技发展有限公司）；Herens Pico 21离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；AE-240电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；pHS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）；Milli-Q5 超纯水机（德国默克密理博公司）。
1.2 药品和试剂
金刚烷胺（纯度：97%，批号：MKBF8627V）购自美国Sigma公司；盐酸伪麻黄碱（内标纯度：100%，批号：171237-200304）由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、甲酸、乙腈为色谱纯（德国默克公司），二氯甲烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；超纯水（德国默克密理博公司）。
2 实验方法
2.1 对照品溶液和内标溶液的配制
精密称取金刚烷胺对照品2.33 mg，置于100 ml量瓶，用超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为23.3 μg·ml-1的金刚烷胺储备液。将金刚烷胺储备液稀释200倍配成116.5 ng·ml-1金刚烷胺工作液，备用；精密称取内标盐酸伪麻黄碱对照品1.24 mg，置于100 ml量瓶，用超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为12.4 μl·ml-1的盐酸伪麻黄碱储备液。用超纯水稀释盐酸伪麻黄碱储备液，配制成2.5 μg·ml-1的内标溶液。
2.2 色谱条件
采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流动相为0.01%甲酸水（A）—甲醇（B）。流速：0.25 ml·min-1；进样体积：5μl；柱温为30 ℃。采用梯度洗脱，即0 min时，A：B=（80：20，v/v），1.5min 时，A：B=（10：90，v/v）2 min 时，A：B=（10：90，v/v），4 min 时，A：B=（80：20，v/v）。
2.3 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI源），多反应离子监测（MRM）正离子模式；金刚烷胺离子反应为：m/z152.2→135.48；毛细管电压3.7 kV，锥孔电压35 V，碰撞能量16 eV；内标伪麻黄碱离子反应：m/z166.29→148.29；毛细管电压3.7 kV，锥孔电压20 V，碰撞能量10 eV。
2.4 血浆样品处理
取血浆样品500 μl置10 ml玻璃离心管中，加入20 μl内标溶液（2.5 μg·ml-1），混合后加入2 ml二氯甲烷，涡旋混匀2 min，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液1.5 ml，40℃水浴中以氮气流吹干，残渣加1 ml流动相复溶，涡旋3 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，1 μl进样。
2.5 方法学考察
2.5.1 基质效应考察 分别取5种不同来源的空白血浆500 μl，经液液萃取N吹干后，加入流动相配置的金刚烷胺和内标伪麻黄碱混合溶液（金刚烷胺浓度依次是1、150、600 ng·ml-1每个浓度各5 管），通过UPLC-MS/MS法分析，获得峰面积，与相应浓度混合对照品溶液峰面积之比评价基质效应，结果均在88%～100%之间，结果表明，本方法金刚烷胺及其内标的测定均不受基质效应干扰。
2.5.2 标准曲线制备 取金刚烷胺工作液加入空白血浆中，配制成浓度为 0.7，2.8，7，28，70，140，280，700 ng·ml-1的含药标准血浆样品，按”2.4”处理后，再按“2.2”“2.3”条件进样测定，记录色谱图；以金刚烷胺浓度（x）为自变量，峰面积和内标峰面积比（y）为应变量，用加权（W=1/χ2）最小二乘法进行线性回归分析，得回归方程：y=0.01261x+0.01737（r=0.997 3），结果表明，金刚烷胺在0.7～700 ng·ml-1范围内（r=0.997 3）有良好线性关系，定量下限为0.7 ng·ml-1。
2.5.3 专属性试验 空白血浆、含药血浆样品（含内标）和患者血浆样品（含内标）分别按“2.2”“2.3”“2.4”方法考察血浆中内源性物质及常规合并用药是否干扰测定。所得色谱图见图1。金刚烷胺与内标的出峰时间分别为2.14 min、1.00 min；二者能很好地分离，峰形良好，无杂质峰干扰。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰金刚烷胺及内标的测定。
图1 金刚烷胺色谱图
表1 回收率和精密度试验结果 （n=5）
表2 金刚烷胺稳定性试验结果（n=5）
2.5.4 回收率和精密度实验 取空白血浆，配制金刚烷胺浓度分别为1、150、600 ng·ml-1的对照品血浆各5份，按“2.4”操作并进行UPLC-MS分析，将结果与相应浓度对照品水溶液结果比较，求算提取回收率及随行的标准曲线计算方法回收率。同时，每种浓度样品在一日内平行操作测定5次，考察日内精密度。同法每日操作测定1 次，连续5日，考察日间精密度。数据见表1。
2.5.5 稳定性实验 取空白血浆配制成1、150、600 ng·ml-1的含药标准血浆样品各5份，考察样品在不同保存条件下的稳定性。结果表明金刚烷胺经过-20 ℃放置30 d，3次反复冻融，以及室温放置3 d均稳定。
3 讨论
3.1 色谱条件的选择
考察了水、0.01%甲酸和0.1%甲酸，发现流动相中加入甲酸可明显增强待测物响应，且0.01%甲酸效果优于0.1%甲酸；恒速洗脱易使金刚烷胺峰形变宽，梯度洗脱可使峰形良好。
3.2 内标的选择
通过考察伪麻黄碱对血浆中金刚烷胺测定的影响，结果表明用伪麻黄碱作内标其保留时间为1.0 min，而金刚烷胺保留时间为2.14 min，二者分离度达5.5，不会被其它杂质干扰。
3.3 生物样品处理方法的选择
比较了乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、乙醚-二氯甲烷（4：1）（v/v）[11]、环己烷、正戊烷对金刚烷胺的萃取效果，以二氯甲烷效果最好，可显著减少杂质干扰，且萃取回收率最高，故选其为萃取剂。血浆样品处理参考了文献[11-12]萃取剂、涡旋时间以及流动相等并做改进，分离效果良好。
3.4 标曲范围的选择
本研究是为建立测定人血浆金刚烷胺血药浓度方法学，通过前期预实验，得金刚烷胺谷浓度范围（529.73±86.49）ng·ml-1。故选取的标准曲线范围足以用于临床对金刚烷胺的监测。
3.5 实验方法的选择
金刚烷胺临床给药剂量较低，浓度测定灵敏度要求较高，故本实验采用UPLC-MS/MS法，在3 min内完成金刚烷胺的定量分析，提高工作效率。采用MRM模式，屏蔽其他成分的影响，并用内标法定量，极大地提高准确性。
4 小结
本文建立了测定人血浆金刚烷胺血药浓度UPLC-MS/MS 法，该法快速、灵敏、准确、操作简便，可用于血药浓度监测以及药动学相关性研究。
