葡萄白粉病潜在生防菌的筛选

杜兴兰，周建波，冉隆贤

(1.河北省塞罕坝机械林场总场， 河北围场 068466； 2.河北农业大学林学院， 河北保定 071001)

葡萄白粉病是由葡萄白粉菌[Uncinulanecator(Schw.) Burr.]引起的一种真菌病害，几乎遍布世界所有葡萄产区，严重影响葡萄生产[1-4]。生产上防治白粉病主要以化学农药为主，造成环境污染和果实残留，使葡萄品质下降，制约了葡萄产业的发展[5-6]。因此，有必要寻找一种高效、无污染的防治方法。

生物防治以其高效、低毒、低残留、不易产生抗药性等优点逐渐受到重视[7-8]。在国内外，已有对黄瓜白粉病、小麦白粉病和葫芦白粉病等生物防治方面的研究[9-10]，但截至目前，对葡萄白粉病的生物防治方面的研究尚未见报道。因此，筛选对葡萄白粉病防治较理想的生防菌株，具有十分重要的意义。笔者选用链霉菌、荧光假单胞杆菌和恶臭假单胞杆菌及其转基因菌株，开展了葡萄白粉病生物防治的研究，旨在为开发葡萄白粉病的生防制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。链霉菌菌株：龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)、金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)、CN120(Streptomycessp.)和CN121(Streptomycessp.)。细菌菌株：恶臭假单胞杆菌WCS358r及其嗜铁素缺失实变体JM218，转基因菌株WCS358::phl、WCS358::phz和荧光假单胞杆菌CHA0r。WCS358::phl和WCS358::phz是通过遗传工程的方法分别将产生2.4-二乙酰间苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol,DAPG)和吩嗪-1-羧酸的基因转入到WCS358r的基因组中获得转基因菌株[11-13]。

荧光假单胞杆菌P.fluorescensWCS417分离自小麦根际土壤[14-15]。以该菌抗利福平的突变体WCS417r作为亲本菌株，将产生2，4-二乙酰间苯三酚(DAPG)的基因phl[16]插入到WCS417r的染色体上，得到产生不同DAPG产量的12个菌株，分别命名为L1a12、L1b4、L1c4、L1d6、L2a12、L2b6、L2c9、L2d6、L3a12、L3b6、L3c6和L3d6。

1.1.2药剂。20%三唑酮(triadimefon 粉锈宁)1 500倍液，山东东信生物农药有限公司。

1.1.3葡萄品种。葡萄品种来自河北农业大学苗圃的葡萄新品种魏可葡萄。

1.2方法

1.2.1葡萄白粉菌孢子悬浮液的配制。从新鲜感病叶片上直接刮取白粉病菌的孢子，用无菌水配成浓度为3×105个孢子/mL。

1.2.2病原菌接种方法。从室外直接采集20～25 d新鲜叶片用自来水冲洗、晾干，每叶片接种5滴配好的白粉菌菌悬液，每滴10 μL，放至25 ℃光照培养箱中保湿培养，光照时间为12 h/d，20 d后对照充分发病时进行记录。

1.2.3葡萄离体叶片防治试验。分别对4种链霉菌、10种生防菌进行离体叶片试验。在上述配好的生防菌菌悬液中浸泡20 min后，取出后室温下晾干，以无菌水为对照，每个处理重复3次[17-20]，统计发病率。

1.2.4葡萄离体叶片治疗试验。先接种白粉病菌，在25 ℃光照培养箱中保湿培养5 d后，从培养皿中取出叶片，在上述配好的生防菌菌悬液中浸泡5 min，取出后自然条件下晾干，并以无菌水作为对照，每个处理重复3次，放至培养箱中继续保湿培养，20 d后统计发病率。

发病率=接种点发病数/接种点总数×100%

1.3数据分析 利用DPS统计分析软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1链霉菌防治效果由图1可知，用生防链霉菌对葡萄叶片浸泡20 min后，对葡萄白粉病有一定的防治作用，其浸泡生防链霉菌的叶片发病率均低于对照。CN120和 CN121发病率分别为73.3%和66.7%，与对照无显著差异；金色链霉菌和龟裂链霉菌浸泡处理后防治效果最好，其发病率分别为33.3%和40.0%，与对照相比分别降低了60.0和53.3百分点，这两者之间差异不显著，但显著优于对照。说明用金色链霉菌和龟裂链霉菌处理过的葡萄离体叶片在实验室条件下能显著提高对白粉病的抗性。

注：不同小写字母表示不同菌株间差异显著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level图1 链霉病株对葡萄白粉病的防治效果Fig.1 Control effect of Streptomyces strains on Uncinula necator

2.2WCS417r及转phl基因菌株防治效果离体叶片在生防菌菌悬液中浸泡接种后，20 d后观察发病情况。由图2可知，WCS417r和 L3b6发病率分别为45%和40%，有一定的防治作用，但无显著差异。而L1d6、L2d6和L3d6这3个菌株发病率分别为30%、25%和15%，分别比对照降低了65.0、70.0、和80.0百分点，显著优于对照，而这3个菌株之间防治效果无显著差异。说明L1d6、L2d6和L3d6这3个菌株能提高葡萄叶片对白粉病的抗性。

注：不同小写字母表示不同菌株间差异显著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level图2 WCS417r及转phl基因菌株对葡萄白粉病的防治效果Fig.2 Control effect of Pseudomonas spp.strains on Uncinula necator

2.3WCS358r及其转基因菌株和常用药剂防治效果由图3可知，WCS358r、CHA0r和JM218发病率分别为53.3%、60.0%和53.3%，与对照相比发病率均降低，但与对照无显著差异。而WCS358::phz和WCS358::phl和粉锈宁的发病率分别为40.0%、40.0%、和20.0%，分别比对照降低了53.3、53.3和73.3百分点，与对照相比差异显著。

注：不同小写字母表示不同菌株间差异显著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level图3 WSC358r及转基因菌株和常用药剂对葡萄白粉病的防治效果Fig.3 Control effects of Pseudomonas spp.strains and potion on Uncinula necator

3 结论与讨论

该研究通过白粉菌离体叶片试验，从4株链霉菌中选出有防治作用的龟裂链霉菌和金色链霉菌；从WCS358r及其转基因菌株中筛选出有防治效果的WCS358::phz和WCS358::phl菌株；从WCS417r及其转phl基因菌株共5个菌株中筛选出L1d6、L2d6和L3d6 3株有防治效果的菌株。说明WCS358r和WCS417r的转基因菌株具有增强防病的效果。由于环境因素的影响，在试验过程中，筛选结果表现某些差异。因此在每次试验中尽量选取一致的葡萄叶片，严格控制温度和湿度，使条件一致。