不同品种烤烟根际微生物群落结构及多样性研究

李 强，孙敬钊，皮本阳，黄文华，孔午圆，陈 苏，贺 非

(常德市烟草公司临澧县分公司，湖南常德 415000)

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤的形成发育、物质循环、肥力演变以及植物生长等方面有极其重要的作用[1-2]。近年来，随着土地复种指数的提高，以及长期过量施用化肥和农药，导致土壤生态环境不断恶化，土壤板结、微生物种群结构趋劣、烟草病虫害发病率不断上升、烟叶品质下降等问题愈发严重[3-6]。因此，在农业生产中探究土壤微生物多样性变化以及微生物群落结构特征，对保障作物高产稳产、推动烟叶生产可持续发展具有重要意义。

云烟99、云烟87、云烟97和K326是湖南省浓香型特色烤烟主栽品种，前人对其产量、烟叶品质、生长发育等方面研究较多[7-10]，但不同烤烟品种根际微生态环境之间有何差异，目前鲜见报道。因此，笔者通过小区试验，研究不同品种烤烟根际微生物群落结构及多样性差异，以期为改善烤烟根际土壤微生态提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验地概况于2015、2016年在湖南省常德市临澧县进行试验，土壤类型为黏壤土。0～20 cm耕作层土壤pH 5.9，有机质16.8 g/kg，碱解氮114.19 mg/kg，速效磷18.42 mg/kg，速效钾134.46 mg/kg。

1.2试验设计试验共设4个品种处理：云烟99(Y99)、云烟87(Y87)、云烟97(Y97)、K326，每个处理3次重复。采用随机区组设计，各小区面积30 m2，每小区种50株烤烟，行距120 cm，株距50 cm。区组设通道，四周设保护行。

1.3取样及分析方法各品种烤烟于2015年4月10日、2016年4月12日移栽，在烤烟旺长期，即2015年6月11日、2016年6月13日采集根际土壤。按小区5点取样法选取5株烤烟，采用抖土法，先轻轻抖落大块不含根系的非根际土壤，然后轻轻剥离根系表面附着的土壤，获取根际土壤后，用4分法取适量于无菌袋中立即带回实验室。采用Biolog-Eco微平板方法[11]测定土壤微生物代谢功能多样性。

1.4指标计算方法采用平均颜色变化率(average well color development，AWCD)描述土壤微生物群落的代谢活性；采用Shannon多样性指数(H)、Mcintosh均一性指数(U)、Simpson优势度指数(D)表征土壤微生物群落多样性。各指标计算公式[12-13]：

AWCD=∑(Ci-R)/n，式中，Ci、R分别为反应孔、对照孔在590 nm下的吸光度，n为培养基碳源种类数。

H= -∑(Pi×lnPi)，式中，Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比值。

D=1-∑(Pi×Pi)，式中，Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比值。

碳源利用率为整个培养过程中该类碳源相对吸光值之和与整个平板相对吸光值总和的比率。

1.5数据分析试验数据采用Excel 2007进行处理；采用SPSS 17.0软件进行方差分析、主成分分析，差异显著性分析采用Duncan新复极差方法，显著水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1不同品种烤烟根际微生物群落代谢活性AWCD是评价微生物对碳源利用能力的一个重要指标，反映了土壤微生物的代谢活性，AWCD值越大，代谢活性越高[14]。由图1可知，随着培养时间的延长，各品种根际微生物AWCD值呈先不断增加后趋于稳定的趋势。在培养起始的24 h内，各处理AWCD值均较低，说明此时根际微生物群落代谢活性较低，碳源基本未利用；在24 h后，AWCD值急速上升，表明微生物代谢活跃，碳源开始被大量利用；2015年根际微生物AWCD值在168 h趋于平缓，2016年根际微生物AWCD值在144 h趋于平缓，说明此时微生物活性达到稳定。总体上，AWCD值整体表现为K326>Y97>Y87>Y99，说明K326根际微生物群落代谢活性最高，云烟99(Y99)根际微生物群落代谢活性最低。

图1 根际微生物AWCD的动态变化Fig.1 AWCD dynamics of rhizospheric microorganisms

2.2不同品种烤烟根际微生物碳源利用偏好土壤微生物活性反映了群落总体的变化，但未反映微生物群落代谢详细信息，研究土壤微生物对碳源的利用偏好，有助于更加全面地了解微生物群落代谢功能特性。根据微生物对营养物质代谢途径的不同，将Biolog-ECO微孔板上31种底物碳源分为6类：碳水化合物、羧酸类、氨基酸类、胺类、聚合物、酚酸类；利用AWCD值分别计算出2015和2016年不同碳源的利用率，然后得出2年试验的平均利用率，用以表征根际微生物对碳源的利用偏好。

由图2可知，Y99、Y87、Y97、K326根际微生物对6类碳源的利用情况有一定差异，碳源利用率总体以碳水化合物、羧酸类、氨基酸类较高。其中Y99根际微生物对羧酸类碳源利用最多，平均利用率为22.1%，对酚酸类利用最少，平均利用率仅为8.3%。Y87、Y97、K326根际微生物利用最多的均是碳水化合物，平均利用率分别为21.4%、20.3%、19.7%，利用最少的均是酚酸类，平均利用率分别为9.7%、9.5%、13.1%。由此可知，Y99根际微生物偏好羧酸类碳源，而Y87、Y97、K326根际微生物偏好碳水化合物碳源。

图2 不同品种烤烟根际微生物对碳源利用率Fig.2 Carbon source utilization rate by rhizospheric microorganisms of different varieties of flue-cured tobacco

2.3不同品种烤烟根际微生物碳源利用的主成分分析为了进一步探讨4个不同品种烤烟，其根际微生物碳源利用方式的差异，将根际微生物120 h测定的AWCD值进行主成分分析，并根据微生物对各类碳源利用的因子权重值，分析不同品种烤烟根际微生物群落多样性的变化。在2015和2016年的试验中，均提取了5个主成分，累计贡献率分别达94.1%、95.8%，第1主成分(PC1)贡献率分别为59.5%、64.1%，第2主成分(PC2)贡献率分别为12.3%、12.4%。因第3～5个主成分贡献率较小，因此取前2个主成分进行重点分析。

选取PC1和PC2的得分做图来表征微生物群落碳源代谢特征。由图3可知，2015和2016年试验结果均显示，Y87、Y97、K326在PC1的得分均为正值，根际微生物群落碳源利用特征相似，而Y99得分值为负值，表明PC1的碳源是区分Y99与其他3个品种间差异的敏感碳源；Y99、Y87、K326在PC2的得分均为正值，根际微生物群落碳源利用特征相似，而Y97得分值为负值，表明PC2的碳源是区分Y97与其他3个品种间差异的敏感碳源。

碳源载荷值反映了碳源利用与主因子的相关性，载荷值越高，表示其对主成分的影响越大[15]。由表1可知，2015年试验中，与PC1相关性较高(载荷值>0.6)的碳源有26种，其中碳水化合物9种，羧酸类7种，氨基酸类5种，聚合物和胺类均为2种，酚酸类1种；与PC2相关性较高的碳源有3种：β-甲基D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸、L-苯基丙氨酸，分别属于碳水化合物、羧酸类、氨基酸类。由图3可知，碳水化合物、羧酸、氨基酸是区分云烟99(Y99)与其他3个品种间差异的敏感碳源。

2016年试验中，与PC1相关性较高的碳源有28种，其中碳水化合物9种，羧酸类7种，氨基酸类6种，聚合物、酚酸类、胺类均为2种；与PC2相关性较高的碳源有2种：a-丁酮酸、肝糖，分别属于羧酸类、聚合物。碳水化合物、羧酸、氨基酸是区分Y99与其他3个品种间差异的敏感碳源，这与2015年试验结果一致。

图3 主成分分析Fig.3 Principal component analysis

碳源类型Carbon source type底物Substrates2015年PC1PC22016年PC1PC2碳水化合物D-甘露醇D-Mannitol0.966 0.844 Carbonhydratesa-D-乳糖a-D-Lactose0.925 0.710 丙酮酸甲脂Pyruvic Acid Methyl Ester0.840 0.942 I-赤藻糖醇I-Erythritol0.802 0.875 D-纤维二糖D-Cellobiose0.754 0.855 葡萄糖-1-磷酸盐Glucose-1-Phosphate0.753 0.699 D-木糖D-Xylose0.736 0.623 β-甲基D-葡萄糖β-Methyl-D-Glucoside0.726 0.601 0.661 N-乙酰基-D-葡萄胺N-Acetyl-D-Glucosamine0.634 0.863 羧酸类a-丁酮酸a-Ketobutyric Acid0.865 0.746 0.603Carboxylic acidsD-葡萄胺酸D-Glucosaminic Acid0.860 0.929 D-苹果酸D-Malic Acid0.843 0.846 衣康酸Itaconic Acid0.801 0.823 D-半乳糖内酯D-Galactonic Acid y-Lactone0.760 0.768 y-羟基丁酸y-Hydroxybutyric Acid0.675 0.601 D-半乳糖醛酸D-Galacturonic Acid0.613 0.614 0.817 D,L-a-甘油D,L-a-Glycerol氨基酸类L-天冬酰胺酸L-Asparagine0.920 0.959 Amino acidsL-丝氨酸L-Serine0.859 0.959 L-精氨酸L-Arginine0.854 0.815 L-苏氨酸L-Threonine0.809 0.847 甘氨酰-L-谷氨酸Glycyl-L-Glutamic Acid0.800 0.898 L-苯基丙氨酸L-Phenylalanine0.790 0.815 聚合物吐温80 Tween 800.911 0.905 Polymers吐温40 Tween 400.910 0.954 肝糖Glycogen0.676a-环式糊精a-Cyclodextrin0.637 酚酸类4-羟基苯甲酸4-Hydroxy Benzoic Acid0.887 0.919 Phenolic acids2-羟基苯甲酸2-Hydroxy Benzoic Acid胺类苯乙基胺Phenylethyl-amine0.814 0.863 Amines腐胺Putrescine0.634 0.727

2.4不同品种烤烟根际微生物群落功能多样性指数不同多样性指数可以从不同方面来描述微生物群落的多样性，多样性指数越大，微生物群落功能多样性越高[16]。其中Shannon多样性指数用来表征生态系统中的物种及其个体数；Simpson优势度指数反映群落中优势种群的数量；Mcintosh均一性指数用来描述群落中个体分布的均匀情况[17-18]。

由表2可知，不同品种烤烟，根际微生物群落多样性指数存在一定差别。各处理Shannon指数、Simpson指数在2年的试验中均无显著变化，可见不同品种烤烟之间根际微生物种类和优势种群数量无显著差异。Mcintosh指数在2年试验中均表现为K326>Y97>Y87>Y99的规律，且各处理间存在显著差异；其中K326的根际微生物Mcintosh指数最大，平均为7.652，Y99最小，平均为5.588，前者是后者的1.37倍。综合而言，不同品种的烤烟，其根际微生物种类和优势种群数量并无差异，但微生物种群的分布情况存在显著差异，尤以K326根际微生物群落物种分布最均匀。

表2根际微生物群落多样性指数

Table2Diversityindicesofrhizosphericmicroorganismscommunities

年份Test year品种CulticarShannon 指数 Shannon index(H)Mcintosh 指数 Mcintosh index(U)Simpson 指数Simpson index(D)2015Y993.119 a5.704 d0.949 aY873.134 a6.391 c0.954 aY973.274 a7.221 b0.959 aK3263.244 a7.661 a0.957 a2016Y993.158 a5.472 d0.952 aY873.253 a6.312 c0.957 aY973.273 a7.130 b0.959 aK3263.169 a7.643 a0.954 a

注：同列不同小写字母表示不同品种间差异显著(P<0.05)

Note:Different lowercases in the same column stand for significant differences between different varieties at 0.05 level

3 结论与讨论

微生物对碳源利用能力可以反映微生物群落代谢活性水平。王戈等[19]通过研究云85、K326、净叶黄、红花大金元4种烤烟根际微生物数量及多样性的差异，发现不同品种烤烟根际微生物对碳源总体利用能力存在一定差异，其中云85根际微生物群落代谢活性最高。该研究结果表明，根际微生物群落代谢活性表现为K326>Y97>Y87>Y99，K326根际微生物群落代谢活性最高，云烟99根际微生物群落代谢活性最低。

根际土壤微生物对碳水化合物、羧酸类、氨基酸类、胺类、聚合物和酚酸类6类碳源的利用率在一定程度上反映微生物的群落结构。蔡秋华等[20]研究发现，在寻甸试验点，不同品种对碳源的利用率表现为K326>云烟87>红花大金元；在石林试验点，利用率则表现为红花大金元>K326>云烟87。该研究结果表明，云烟99根际微生物对羧酸类碳源利用最多，而云烟87、云烟97、K326根际微生物对碳水化合物碳源利用最多。

主成分分析结果表明，云烟87、云烟97、K326得分值集中分布在PC1正半轴，而云烟99则位于PC1负半轴；碳水化合物、羧酸类、氨基酸类这3类碳源在PC1上相关性较高，综合分析认为，云烟87、云烟97、K326偏好碳水化合物、羧酸类、氨基酸类物质。

许玲[21]通过分析12个不同品种烤烟节肢动物群落结构的差异，发现豫烟6号的多样性、均匀度、优势集中性都较高，Y8324各群落特征指数较低。该研究结果表明，不同品种的烤烟，其根际微生物种类(Shannon指数)和优势种群数量(Simpson指数)并无差异，Mcintosh指数在2年的试验中均表现为K326>Y97>Y87>Y99的规律，表明K326根际微生物群落物种分布最均匀。