四唑染色法快速测定菊芋种子生活力的研究

丁 鹏

（博爱县动物卫生监督所，河南 博爱 454450）

菊芋（Helianthus tuberosus）俗名洋姜，菊科，向日葵属，多年生草本植物［1］。菊芋根系发达，可改善土壤的结构，增加孔隙率和水稳性团粒结构，且耐旱、耐寒，块茎能够在-40～25℃的冻土层内安全越冬，适应性极强，且不影响出苗［2］。因此，可用于我国北方干旱、风沙区的土地绿化、防风固沙，防止水土流失，且在荒坡地、盐碱地、城乡空闲地等处零星或成片种植，能够绿化环境、增加经济收入。菊芋是中等耐碱植物，种植菊芋可降低土壤中的盐碱量对改良土壤具有很大的作用［3］。菊芋的营养成分中，碳水化合物的78%为菊糖［4］，因此，可用于炒食或腌渍加工成酱菜食用，或将其菊糖加工成果糖，提取酒精、香精等。菊芋也有很强的药用价值，提取的菊糖可作为利尿剂，用于糖尿病辅助治疗，或将块茎捣碎外敷，用以消除肿毒等。此外，菊芋的茎、秆和块根均可用作饲料，发展畜牧业。菊芋特有的花香、花蜜可招引蜜蜂采集，故可人工放养，发展养蜂业［5］，是一种极具开发潜力的半野生资源。

菊芋生产上一般用块茎繁殖，但随着菊芋用途的开发，需要对其品种质量进行改良而进行杂交育种，但杂交后的种子繁殖时发芽率低，严重影响了菊芋用途的开发，因此，检测其杂交育种后种子生活力，探明其发芽率低的原因是菊芋开发利用亟待解决的问题。种子生活力的测定方法较多，常用的简单易行的种子生活力测定方法主要有：发芽指数法、活力指数法、电导率测定法、四唑染色法等。发芽指数法克服了田间气候复杂因素的影响，能反映出苗速度和出苗整齐度，但它缺少幼苗生长趋势的反映。活力指数法在这个基础上增加了根、芽的重量或长度因子，虽然能反映出苗势，但它没有反映种子在不同逆环境条件下的发芽情况，且在不同粒度种子之间可比性较小。电导率测定法可在室内同时测试大量样品，但会因为种子老化或受不良外界条件影响而使细胞的膜系统发生变化，导致活力降低，且在种子大粒，小粒以及水分一致性上要求极为严格。赵增煌等［6］报道以上几种方法都无法测定菊芋种子的生活力。四唑染色法是通过鉴定种子内部活组织的染色情况，从而对种子的质量进行检验。该方法可快速测定发芽缓慢或有休眠种子的生活力，具有快速、经济、准确和应用范围广泛等特点［7］。该研究中，选择四唑染色法，根据种子胚部是否染成红色及染色的部位、形状和大小，来判断种子生活力，同时也为快速、准确地进行菊芋种子质量检测和提高菊芋种子发芽率提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

该试验使用的种子采集于甘肃省兰州市兰州大学榆中校区试验田，该地区属温带大陆性气候，冬季寒冷，夏季酷热，年平均降水量360 mm，年平均气温10℃，全年日照时数平均2 446 h，无霜期180 d以上。采集的菊芋种子经测定千粒重为6.333 g，风干后装进布袋，置于室温储藏。

1.2 染色方法

1.2.1种子的预处理：取颗粒饱满、发育成熟的菊芋种子4 000粒，放入烧杯中，并加入蒸馏水，置于25℃培养箱浸种，直至全部种子充分吸胀。浸种结束，用解剖针小心切开并剥去种壳，取出种子。

1.2.2TTC溶液的配制：用pH值6.5～7.5的蒸馏水，分别配制 1.0%、0.5%、0.2%、0.1%的 TTC溶液，贴上浓度标签，避光保存。

1.2.3染色： 分别于 25、30、35、40 、45 ℃温度下，用浓度为1.0%、0.5%、0.2%、0.1%TTC溶液对菊芋种子进行避光染色，共20个处理，每个处理4次重复，50粒/重复。每隔1 h观察1次，并记录染色完成所需时间。染色时间以着色稳定为止。

1.2.4判读：染色结束后，滤去溶液，用清水冲洗，将种子摆在湿润的滤纸上，根据种子染色的部位、染色面积的大小和染色程度，逐粒判断种子的生活力。其中胚根、子叶全部染色的种子记为有生活力的种子；胚根染色、子叶部分染色的种子记为有生活力的种子；胚根染色，子叶没有染色的种子记为无生活力的种子；胚根未染色、子叶染色的种子记为无生活力的种子；胚根、子叶均不染色者记为无生活力的种子。

表1 不同温度与TTC浓度下菊芋种子的染色情况及生活力

表2 不同温度与TTC浓度下菊芋种子的染色情况方差分析结果

1.2.5生活力的计算：将经判读有活力的种子数除以供试种子总数，即得出种子的生活力。

1.2.6种子发芽率的测定：取颗粒饱满、发育成熟的菊芋种子400粒，使用2%NaOH溶液浸泡20 min消毒，剥去其中200粒种子的种壳，分为4组，每组50粒；另外200粒未剥壳种子，分为4组，每组50粒。将分组后的种子放入培养皿中进行萌发实验，培养皿中放入普通滤纸作为发芽床，将种子均匀放入，加入适量蒸馏水，使滤纸保持湿润，加盖，置于25℃培养箱发芽。以种子着床当天为第1天，逐日观察统计其发芽率，直到连续2 d发芽种子数目不再改变为止，期间注意保持滤纸湿润。种子发芽率的计算公式为：

发芽率=发芽的种子数/供试种子总数×100%

2 结果与分析

2.1 不同温度和TTC浓度下菊芋种子的染色情况及生活力

不同温度与TTC浓度下菊芋种子的染色情况及生活力如表1和表2所示。同一TTC浓度下，25～45℃条件下，随着温度增高，菊芋种子的染色数总体上呈现出先增加后降低的趋势，其中35℃条件下，菊芋种子染色数最多。在25～45℃温度范围内，温度相同时，菊芋种子的染色数随着TTC浓度的增加同样呈现出先增加后降低的趋势，浓度为0.5%时，菊芋种子的染色数最高。染色温度与浓度的交互条件下，TTC浓度0.5%，染色温度35℃条件下，菊芋种子染色数最多。因此，四唑染色法测定菊芋种子活力的适宜TTC浓度为0.5%，适宜温度为35℃，在该条件下测得的菊芋种子生活力为72%。

2.2 不同TTC浓度与温度下所需染色时间

不同TTC浓度与温度下所需染色时间如图1所示，TTC浓度越高，染色反应速度越快，所需时间越短；染色温度越高，染色反应的速度也越快，所需时间越短。在菊芋种子染色数最多的TTC浓度和染色温度下其染色时间为7 h。

2.3 菊芋种子发芽率测定结果

菊芋种子发芽率测定结果如表3，未剥壳的供试菊芋种子发芽率为0，而剥壳后菊芋种子的发芽率为35%。

表3 菊芋种子发芽率

图1 不同TTC浓度和温度下菊芋种子所需染色时间

3 讨论

四唑染色法测定种子活力原理可靠、方法简便、省时快速，可较准确地检测菊芋种子生活力水平的高低，估计种子的潜在发芽能力，但在染色时需严格掌握TTC溶液浓度和染色温度。按照《国际种子检验规程》［7］的规定，种子四唑染色法浓度不宜超过1.0%，因此1.0%可作为TTC溶液浓度的上限，TTC溶液浓度越高，染色温度越高，染色时间越短，因此在染色过程中控制好适宜的染色时间十分重要，否则所染颜色的不理想，会给鉴定带来困难，影响测定结果。

研究表明［8］，四唑染色法测定结果与标准发芽率一般很接近，四唑染色法是最有希望代替发芽试验的方法。在该试验中，剥壳后种子的发芽率与菊芋种子的生活力测定结果并不完全一致，结果与在玉米等其他种子上的研究结果相似［9-10］。因此，该试验中四唑染色法测定的生活力只能用于估测种子潜在发芽能力，还不能完全取代发芽试验。试验中未剥壳种子能吸胀但不能发芽，而种子剥壳后可以发芽，这表明菊芋种子的休眠不是由于种壳的不透水而引起的物理休眠，而是种壳上存在某种影响休眠的物质导致菊芋种子的休眠。然而该试验研究有限，因此菊芋种子的休眠机制及破除其种子休眠的方法有待于进一步研究。