高效液相色谱法测定衢枳壳中新橙皮苷及柚皮苷

2018-10-31

食品研究与开发 2018年21期

（浙江省果品质量检验中心，浙江常山324200）

衢枳壳为芸香科植物常山胡柚[1-3]（citrus chang shan-huyou）的干燥未成熟果实，主产浙江，7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥制成，有衢枳壳、麸炒衢枳壳、麸衢枳壳、蜜衢枳壳、衢枳壳炭5种饮片。2015版《浙江省中药炮制规范》修订后，将“常山胡柚片”收录其中，并正式命名为“衢枳壳”。衢枳壳味苦、辛、酸，性微寒，归脾、胃经，有理气宽中、行滞消胀功效，可用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症[4-7]。2018年，衢枳壳与铁皮石斛、灵芝、西红花等浙江省内知名中药材一并入选新“浙八味”中药材培育品种名单。

新橙皮苷及柚皮苷是衢枳壳的主要活性成分[8-11]，其含量的高低直接影响衢枳壳的功效，因此测定衢枳壳中两种功能成分的含量具有重要意义。

建立高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定衢枳壳中的新橙皮苷及柚皮苷的方法，对加强“衢枳壳”有效物质研究，保障药材质量安全，规范市场秩序、促进“衢枳壳”产业持续健康发展、推动胡柚产业转型发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Waters e2695高效液相色谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；Thermo u3000液相色谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；VARIAN液相色谱仪：瓦里安公司；HH-4恒温水浴锅：江苏常州国华电器有限公司；XS105DU分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ2200型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；超纯水器：杭州永洁达净化科技有限公司。新橙皮苷对照品（纯度：98.76%）、柚皮苷对照品（99.33%）：上海安谱实验科技股份有限公司；衢枳壳：常山县柚王中药材有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯）、磷酸（分析纯）：国药集团；水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（20 ∶80）（用磷酸调节 pH 值至 3.0）；检测波长为 283 nm；流速：1.0 mL/min，柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

1.3 标准液的制备

1.3.1 新橙皮苷储备液的配制

精密称取干燥至恒重的新橙皮苷对照品19.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.91 mg/mL的新橙皮苷储备液，2℃～8℃保存备用。使用时取出放至室温。

1.3.2 柚皮苷储备液的配制

精密称取干燥至恒重的柚皮苷对照品19.5 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.95 mg/mL的柚皮苷储备液，2℃～8℃保存备用。使用时取出放至室温。

1.3.3 新橙皮苷柚皮苷混合对照品溶液的配制

精密吸取新橙皮苷储备液和柚皮苷储备液各1 mL至25 mL容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，即得含新橙皮苷74.6 μg/mL、柚皮苷78.0 μg/mL的混合标准溶液。

1.4 供试品溶液的制备[12-16]

取衢枳壳粗粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1.5 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2 结果与分析

2.1 HPLC图谱

分别将新橙皮苷储备液和柚皮苷储备液以甲醇稀释至约80 μg/mL进样，得到新橙皮苷色谱图和柚皮苷色谱图；将新橙皮苷柚皮苷混合对照品溶液进样，得到新橙皮苷柚皮苷混标色谱图；供试品按照“1.4供试品溶液的制备”方法处理进样，得到供试品色谱图。结果如图1。

结果显示，在此色谱条件下，新橙皮苷与柚皮苷分离较好，专属性高。

2.2 线性范围

分别精密吸取新橙皮苷储备液和柚皮苷储备液适量，依次配制成含新橙皮苷和柚皮苷分别为①305.6 μg/mL，312.0 μg/mL②152.8 μg/mL，156.0 μg/mL③76.4 μg/mL，78.0 μg/mL④38.2 μg/mL，39.0 μg/mL⑤19.1 μg/mL，19.5 μg/mL 的系列混合对照品溶液，10 μL进样。相当于新橙皮苷和柚皮苷质量依次为①3.056 μg，3.12 μg ②1.528 μg，1.560 μg ③0.764 μg，0.780 μg④0.382 μg，0.390 μg ⑤0.191 μg，0.195 μg。检测峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程分别为：Y=19 400X+32 700（R2=0.999 9）和 Y=14 300X+27 200（R2=0.999 9）。结果表明，新橙皮苷在 0.191 μg～3.056 μg、柚皮苷在 0.195 μg～3.120 μg质量浓度范围内呈良好的线性关系。

图1 新橙皮苷与柚皮苷含量测定的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of neohesperidin and naringin

2.3 稳定性试验

取同一批供试品按照“1.4供试品溶液的制备”方法处理后，在室温25℃下放置，分别按前述色谱条件在0、24、48 h进样，根据样品溶液中新橙皮苷和柚皮苷的峰面积，考察溶液的稳定性，计算相对标准偏差RSD，计算结果如表1。

表1 稳定试验结果Table 1 Results of stability test

以上试验结果表明，供试品溶液中新橙皮苷和柚皮苷均在48 h内稳定。

2.4 精密度试验

将新橙皮苷柚皮苷混合对照品溶液，重复进样5次，根据峰面积，计算相对标准偏差RSD，计算结果如表2。

表2 精密度试验结果Table 2 Results of precision test

结果表明进样精密度RSD均小于3.0%，符合测定要求。

2.5 回收率试验

供试品溶液的制备：精密称取已知含量的供试品0.2 g，精密加入一定量对照品，使对照品加入量与所取供试品中待测定成分质量之比在1∶1左右，按照“1.4供试品溶液的制备”方法处理进样。平行制备6份供试品。计算结果如表3、表4。

表3 新橙皮苷回收率试验结果Table 3 Results of recovery test for neohesperidin

表4 柚皮苷回收率试验结果Table 4 Results of recovery test for naringin

回收率/%=（实测量-供试品所含被测成分量）/加入对照品量×100

2.6 重复性试验

取同一批供试品6份，按照“1.4供试品溶液的制备”方法处理进样，得到测定结果，计算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相对标准偏差RSD，结果如表5。

表5 重复性试验结果Table 5 Results of repeated test

结果表明，该方法测定样品的含量，重复性好。

2.7 中间精密度

取同一批供试品3份，按照“1.4供试品溶液的制备”方法处理后，于连续3天内分别进样，计算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相对标准偏差RSD，结果如表6。

表6 不同日期中间精密度试验结果Table 6 Results of inter-assay precision of different days

由3名不同试验人员取同一批供试品3份，按照“1.4供试品溶液的制备”方法处理后进样，计算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相对标准偏差RSD，结果如表7。

表7 不同人员中间精密度试验结果Table 7 Results of inter-assay precision of different persons

同一批供试品3份，按照“1.4供试品溶液的制备”方法处理，采用相同的色谱条件，注入不同的液相色谱仪（Waters e2695液相色谱仪、Thermo u3000液相色谱仪、VARIAN液相色谱仪）。计算新橙皮苷、柚皮苷的含量和相对标准偏差RSD，结果如表8。

表8 不同仪器中间精密度试验结果Table 8 Results of inter-assay precision of different instruments

结果显示，供试品在不同日期内处理进样、由不同试验人员进行样品处理或采用不同仪器分析中间精密度均小于3%，方法受随机变动因素的影响小。

2.8 耐用性

对不同品牌色谱柱、不同柱温、不同流速及不同比例流动相进行考察。色谱柱：采用Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、CNW Athena C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3个不同品牌色谱柱进样，理论塔板数、分离度等均能达到要求。结果见表9。

表9 不同品牌色谱柱考察系统适应性参数Table 9 Results of system adaptability test of different chromatographic column

柱温：设置25、27、30℃3个不同柱温条件进样，结果见表10。

表10 不同柱温考察系统适应性参数Table 10 Results of system adaptability test of different column temperature

流速：设置0.8、1.0、1.2 mL/min 3个不同流速条件进样，表11。

表11 不同流速考察系统适应性参数Table 11 Results of system adaptability test of different flow rate

流动相：采用乙腈-水（20∶80）（用磷酸调节pH值至 3.0）、乙腈-水（21 ∶79）（用磷酸调节 pH 值至 3.0）、乙腈-水（19∶81）（用磷酸调节pH值至3.0）3个不同比例流动相条件进样。结果见表12。

表12 不同比例流动相考察系统适应性参数Table 12 Results of system adaptability test of different mobile phase ratio

结果显示，在各考察条件下理论塔板数、分离度等均能达到要求，因此方法在所考察因素有小的变动时，结果不受影响。综合考虑，选择Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱作为此方法常用检测色谱柱、流动相比例为乙腈-水（20∶80）（用磷酸调节pH值至3.0）、柱温 25℃、流速 1.0 mL/min。