响应面法优化超声波-微波协同提取黑果枸杞叶总黄酮工艺

段亚云，李建颖，程瑶，李金荣

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）为茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）植物，主要生长在荒地、沙漠等较干旱地区。在我国主要分布于山西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆等省份[1]，是我国西北荒漠地区极其珍贵的药食两用珍品，亟待开发[2]。其果实可以滋肝补肾，调节气血，明目降压[3]，其叶可以制茶，降血脂，抗衰老。黄酮类物质是植物中重要的次生代谢产物之一，具有吸收紫外线、抗癌、抗氧化、免疫等多种功效[4-5]，目前广泛应用于食品工业、医疗保健和化妆品等行业[6]。现代研究表明[7-8]，黑果枸杞叶中含有丰富的黄酮类物质，且其具有广泛的生理活性和营养保健作用。研究黑果枸杞叶总黄酮的提取工艺对于进一步开发利用黑果枸杞具有重要意义。

超声波对黄酮类化合物的提取主要源于其空化作用，致使溶液内部产生较强的冲击波，同时伴有强烈的机械效应和热效应，能从整体上提高提取过程的传质速率和效果，缩短提取时间[9-10]。微波对分子间作用力以及氢键等具有较强的破坏力，是一种非电离的电磁辐射。相比较超声波来说，微波可使溶剂和溶质均匀受热，克服了热水浸提法易糊化的缺点，有利于细胞中有效成分的溶出，且时间短，用量少，效率高。因此，超声波-微波协同提取法可以将两种方法结合起来，实现优势互补，从而可获得更高的提取率[11]。本试验将采用超声波-微波协同提取技术，研究不同因素条件对黑果枸杞叶总黄酮提取率的影响，通过响应面优化试验确定最佳工艺条件，为黑果枸杞叶的综合开发提供理论依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑果枸杞叶：甘肃省民勤县；芦丁（Standard）：德国Dr.Ehrdnstorfer Gmbh公司；乙醇（AR）：天津市凯通化学试剂科技有限公司；盐酸（AR）、氢氧化钠（AR）、硝酸铝（AR）、亚硝酸钠（AR）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

BSA224S-CW分析天平：德国Sartorius集团；RV10DIGITAL旋转蒸发仪：德国IKA公司；UV-2600紫外可见分光光度计：日本Shimadzu；RV10DIGI TALXO-SM50超声波-微波协同反应系统：南京先欧仪器制造有限公司；Spex 6875冷冻研磨仪：美国Spex；DW-86L290（J）超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；DH-101电热鼓风干燥箱：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

将黑果枸杞叶置于100℃烘箱中杀青30 min，后放入60℃干燥箱中，烘干至恒重，粉碎后过100目筛，置于干燥器中备用。

1.2.2 芦丁标准曲线的制定

准确称取0.0200g芦丁标准品，置于100.0mL容量瓶中，用70%乙醇溶解定容，制成浓度为0.2000mg/mL的标准品溶液[12]。将上述溶液用70%乙醇稀释成浓度为 0.000、0.010、0.020、0.040、0.080、0.120、0.160、0.180、0.200 mg/mL溶液。各取1 mL置于试管中，向其中分别加入1 mL70%乙醇和0.5 mL 5%的NaNO2溶液，混匀后静置6 min。再加入0.5 mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6 min，最后加入2 mL 4%NaOH，混匀后放置15 min。测定每组溶液在510 nm下的吸光度值。以芦丁标准液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，求得回归曲线方程A=9.515 15C+0.090 866 7（R2=0.999 3），线性范围：0.008 mg/mL～0.028 mg/mL。

1.2.3 总黄酮提取工艺

准确称量2.000 g处理好的黑果枸杞叶粉末，采用超声波-微波协同反应系统（超声频率为40 kHz），通过改变微波功率、液料比、提取时间和乙醇浓度4个条件进行提取，旋蒸后将提取液置于-80℃超低温保存箱内进行预冻24 h，将处理好的样品进行冷冻干燥48 h，即得样品粉末。

1.2.4 总黄酮含量的测定

取一定质量的待测样品粉末，用70%乙醇溶解后取一定体积的样品液，用70%乙醇定容至某一体积。取定容后的溶液1 mL，置于试管中。按1.2.2的方法测定待测溶液在510 nm下的吸光度值，带入标准曲线中，求出粗提物中总黄酮的含量。根据算得的样品液中总黄酮浓度，按如下公式，计算总黄酮提取率。

式中：x为样品中总黄酮提取率，%；C为由回归方程算得的样液浓度，mg/mL；V1为样液体积，mL；V2为样品定容体积，mL；V3为显色反应测定时取用样品的体积，mL；m 为样品质量，mg。

1.2.5 单因素试验

1.2.5.1 微波功率对总黄酮提取率的影响

采用超声波-微波协同提取的方法，以60%乙醇为提取溶剂，在液料比为25∶1（mL/g），超声功率为200 W，提取时间12 min的条件下，分别在100、125、150、175、200 W的微波功率下提取黑果枸杞叶总黄酮。

1.2.5.2 液料比对总黄酮提取率的影响

采用超声波-微波协同提取的方法，以60%乙醇为提取溶剂，在微波功率为200 W，超声功率为200 W，提取时间 12 min的条件下，分别设定 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）的液料比条件，提取黑果枸杞叶总黄酮。

1.2.5.3 提取时间对总黄酮提取率的影响

采用超声波-微波协同提取的方法，以60%乙醇为提取溶剂，在液料比为25∶1（mL/g），微波功率为200 W，超声功率为200 W的条件下，分别设定6、8、10、12、14 min的提取时间，提取黑果枸杞叶总黄酮。

1.2.5.4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

采用超声波-微波协同提取的方法，在液料比为25∶1（mL/g），微波功率为 200 W，超声功率为 200 W，提取时间12 min的条件下，分别采用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇为提取溶剂，提取黑果枸杞叶总黄酮。

1.2.5.5 超声功率对总黄酮提取率的影响

采用超声波-微波协同提取的方法，以60%乙醇为提取溶剂，在液料比为25∶1（mL/g），微波功率为200 W，提取时间12 min的条件下，分别考察超声功率为 100、200、300、400、500 W 对黑果枸杞叶总黄酮提取率的影响，发现超声功率对其影响极不显著，从节约能耗角度考虑，最终选择超声功率200 W。

1.2.6 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，运用Design-Expert 8.0软件，根据Box-Behnken中心组合试验原理[13]，分别选取微波功率（A）、液料比（B）、提取时间（C）及乙醇浓度（D）4个因素，以总黄酮提取率为响应值，设计响应面试验，因素和水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 结果与分析

2.1 微波功率对总黄酮提取率的影响

微波功率对黑果枸杞叶总黄酮提取率的影响如图1所示。

图1 微波功率对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of total flavonoids

随着微波功率的增大，提取率逐渐增大，在功率为175 W的时候，提取率达到最大值，因为初始阶段，随着功率的增大，微波作用逐渐加强，加速黄酮物质的溶解。但功率继续增大时，提取率下降明显，可能是因为随着功率的进一步加强，温度升高，会破坏一些黄酮物质[14]，也会导致部分溶剂挥发，致使提取率降低。所以微波功率以175 W左右为宜。

2.2 液料比对总黄酮提取率的影响

液料比对总黄酮提取率的影响如图2所示。

图2 液料比对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-soild ratio on the extraction rate of total flavonoids

随着液料比的逐渐增加，溶剂对黄酮类物质进行更加充分的溶解，在液料比为20∶1（mL/g）时达到最大。但随着液料比的进一步增大，可能会导致一些其他杂质成分溶出，降低总黄酮提取率[14]。最终选择液料比为 20 ∶1（mL/g）。

2.3 提取时间对总黄酮提取率的影响

提取时间对总黄酮提取率的影响如图3所示。

随着提取时间的延长，总黄酮提取率逐渐增大，并在提取时间为10 min时达到最大值，但随着时间的进一步延长，可能会导致部分黄酮类物质发生分解，致使提取率降低。所以，最终选择提取时间为10 min。

图3 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对总黄酮提取率的影响如图4所示。

图4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

随着乙醇浓度的逐渐增大，总黄酮的提取率快速提高，但在乙醇浓度达到70%之后，提取率基本不再发生改变，可能是黑果枸杞叶黄酮更易溶于高浓度乙醇，为降低成本，最终选择乙醇浓度为70%。

2.5 响应面优化黑果枸杞叶总黄酮提取条件

2.5.1 响应面试验结果

以单因素试验结果为基础，依据Box-Behnken中心组合试验原理，以黑果枸杞叶总黄酮提取率为响应值，进行响应面分析，试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Result of response surface test

续表2 响应面试验结果Continue table 2 Result of response surface test

2.5.2 模型方程的建立与显著性检验

采用Design-Expert 8.0软件进行方差分析，获得黑果枸杞叶总黄酮提取率对编码自变量微波功率、液料比、提取时间和乙醇浓度的二次多项回归。根据试验结果建立的模型方程为：Y=0.99+0.021A-0.15B-0.027C-0.075D+0.022AB+0.028AC-0.035AD+0.071BC-0.12BD-0.002 8CD-0.24A2-0.32B2-0.39C2-0.27D2，分析结果见表3。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

续表3 回归模型的方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression model

模型方程中，各项系数的绝对值相对大小直接反映各因素对响应值的影响情况。此方程的二项式系数为负数，故方程图像开口向下有最大值，可进行优化分析。由一次项系数分析得出，各因素对黑果枸杞叶总黄酮提取率的相对影响程度为：B（液料比）＞D（乙醇浓度）＞C（提取时间）＞A（微波功率）。由表3可知此模型极为显著（P＜0.01），液料比与乙醇浓度为极显著因素（P＜0.01），BD 交互极为显著（P＜0.01），BC 交互显著（0.01＜P＜0.05）。失拟项不显著（P＞0.05），说明模型与实际情况拟合较好，使用该方程进行试验分析是可行的。

2.5.3 响应面图分析

为进一步研究各因素之间交互作用的影响，通过Design-Expert绘制的黑果枸杞叶总黄酮提取率三维响应面进行分析。响应面坡度都相对平缓，表明可以忍受处理条件的变异，等高线图中同一椭圆型区域内表示提取率相同，中心最高，越向边缘扩散越低，且椭圆曲线排列越密表明该因素对总黄酮提取率影响越大。同时等高线越接近圆型，说明两因素交互作用越弱，越接近椭圆型，说明交互作用越显著[15]。液料比和提取时间、乙醇浓度两个因素之间的交互作用显著（图5、图6），提取时间和微波功率之间交互作用较弱（图7）。

图5 液料比和提取时间对总黄酮提取率的交互作用Fig.5 Effect of interaction between liquid-soild ratio and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

图6 液料比和乙醇浓度对总黄酮提取率的交互作用Fig.6 Effect of interaction between liquid-soild ratio and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.5.4 验证试验

由优化后的模型方程求解，可得出在试验范围内黑果枸杞叶总黄酮的最佳提取工艺：微波功率175.93 W，液料比 18.88 ∶1（mL/g），提取时间 9.89 min，乙醇浓度69.09%，在此条件下黑果枸杞叶总黄酮的提取率理论上可达1.01%。在实际试验条件下，最佳提取工艺为：微波功率 175 W，液料比 18.9 ∶1（mL/g），提取时间9.9 min，乙醇浓度69%，并在此条件下进行3组平行试验，所得的总黄酮提取率为（0.997±0.015）%，理论预测值为1.01%，结果与预测值基本符合，证明该模型有效。

图7 提取时间和乙醇浓度对总黄酮提取率的交互作用Fig.7 Effect of interaction between extraction time and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

3 结论

本文采用响应面法优化黑果枸杞叶总黄酮的提取工艺，通过对微波功率、液料比、提取时间和乙醇浓度4个因素的考察，液料比和乙醇浓度达到显著水平，主次关系依次为：液料比＞乙醇浓度＞提取时间＞微波功率。利用Design-Expert 8.0软件进行数据分析，并在实际试验条件的矫正下，结果表明黑果枸杞叶总黄酮的最佳提取工艺为：微波功率175 W，超声功率为200 W，液料比 18.9 ∶1（mL/g），提取时间 9.9 min，乙醇浓度69%。在此条件下提取得到的黑果枸杞叶总黄酮提取率为（0.997±0.015）%。利用超声波-微波协同提取法对黑果枸杞叶总黄酮进行提取，最高提取率可达1.01%，明显优于李淑珍等[16]乙醇浸提法，极大程度缩短了提取时间，且提取率明显提高。