毛冬青叶中总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究

唐婷范，邓起东，李晓慧，田玉红

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

毛冬青（Ilex pubescens）为冬青科中的冬青属植物，别名茶叶冬青、山冬青，是我国南方分布广泛的林叶资源，毛冬青叶的成分相对复杂，其化学成分包括挥发油、黄酮、酚类物质、香豆素、氨基酸、甾体、萜烯、糖类等。目前已对毛冬青根的化学成分、药理活性及临床应用等方面进行了比较系统的探讨[1-8]，如廖立平等[9]从毛冬青叶中分离出5种黄酮类化合物，分别为紫云英昔、山奈酚、山柰素-D-半乳糖苷、槲皮素、洋芹素，并且首次从冬青属植物中分离得到山柰素3-0-e-D-半乳糖苷。

黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的具2-苯基色原酮结构的化合物。黄酮类化合物具有多种药理活性，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌消炎、镇痛、保护心脑血管系统和肝脏、延缓衰老抗疲劳、提高免疫力、营养和雌激素作用、促进消化、提高神经兴奋性、抗氧化及清除自由基等良好的药理作用和生物活性[10-12]。王明艳等[13]优化了毛冬青根黄酮提取条件，为了综合利用资源，扩大药源，为毛冬青叶的开发利用奠定基础，本试验对毛冬青叶中总黄酮提取工艺及其抗氧化性能进行初步研究，对于充分利用毛冬青资源具有非常重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毛冬青叶：产于云南；芦丁、碳酸钠、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠、六水合氯化铝、氯化铁、七水合硫酸亚铁（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；无水乙醇（分析纯）：台山市粤侨试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）：广东光华化学厂有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：广东汕头市西陇化工厂；变色硅胶（化学纯）：青岛裕宝精细化工有限公司；水杨酸（分析纯）：中国华东师范大学化工厂（上海）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（分析纯）：日本和光纯药工业株式会社。

1.2 仪器与设备

722N可见分光光度计、JJ200电子天平：上海精密科学仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：金坛市医疗仪器厂；101-1A型数显电热鼓风干燥箱：上海精宏设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毛冬青叶中总黄酮成分的提取[14]

称取2.0 g烘干的毛冬青叶，用60%的乙醇水溶液作为提取介质，在60℃的温度下回流提取2.0 h，提取完成后抽滤，得到粗黄酮提取液。

1.3.2 毛冬青叶中总黄酮含量的测定

参考文献[15]，配制芦丁标准溶液，以亚硝酸钠-硝酸铝显色方法，采用可见分光光度法对毛冬青叶总黄酮提取率进行测定。

1.3.3 毛冬青叶中总黄酮的提取工艺条件优化

考察提取溶剂浓度、料液比、提取时间和提取温度对毛冬青叶总黄酮提取率的影响，根据所得的数据，选出最优化的相邻三组，再结合正交法试验对总黄酮的提取条件进行优化。

1.3.4 毛冬青叶中总黄酮的抗氧化性能

将浓缩后的黄酮浸膏溶解于适量浓度为60%乙醇溶液中，配成不等同质量浓度的水溶液，分别运用Fenton与DPPH法[16]，测定各试样不等同浓度时的A520nm与A517nm，并计算其对OH·和DPPH自由基的消除率。

2 结果与讨论

2.1 毛冬青总黄酮的定量分析方法

2.1.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称量5.0 mg干燥至恒重的芦丁标准样品，以少量60%的乙醇搅拌溶解，而后将其移至50 mL的容量瓶中并定容到刻度，摇匀，得到浓度是0.1 mg/mL的芦丁标准液。

精确吸取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 配制好的标准溶液，依次放于体积为25 mL的具塞比色管中，再加入1 mL浓度为5%的NaNO2溶液，混匀静置6 min，再加入1 mL浓度为10%的A（lNO3）3溶液，摇匀后静置6 min，最后加入10 mL 4%的NaOH溶液，混合后静置15 min，最后加入浓度为60%的乙醇定容到25 mL。测定试验所需波长，用可见分光光度计在波长为450 nm～600 nm内对本体系溶液进行扫描测定吸光度值，结果表明芦丁样液在508nm处吸收最大。在波长为508nm处测量不同浓度梯度标准溶液的吸光度值，根据测量的结果绘制芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

标准曲线的方程是：y=11.927x-0.029 1，相关系数为R2=0.999 8，标准液的曲线线性范围为：0.002 mg/mL～0.014 mg/mL，精密度和稳定性的RSD值分别为0.49%和1.44%，说明该分析方法可行。

2.1.2 总黄酮得率的计算

式中：A为提取液总黄酮的吸光度；V取为移液针取提取液的体积，mL；V液为所用的乙醇溶液提取的体积，mL。

2.2 毛冬青叶中总黄酮的提取工艺条件优化

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取的影响

准确称量5份干燥的毛冬青叶2.000 g，以料液比为1∶60（g/mL），温度为60℃，用50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液回流提取2 h，提取完后，抽滤得到的上清液定容到相应体积，按亚硝酸钠-硝酸铝显色方法显色，用可见分光光度计测定不同乙醇浓度下提取的毛冬青叶总黄酮的吸光度值，即得到不同提取介质的浓度影响毛冬青叶总黄酮提取率的关系见图2。

图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extracting ratio of flavonoids

由图2可知，毛冬青叶总黄酮的提取率受提取介质浓度的影响很大，当提取介质（乙醇）的浓度为60%时，提取液中总黄酮的得率最高，当提取介质浓度超过60%后，随着提取介质浓度的增加，毛冬青叶提取液总黄酮的得率逐渐下降。此结果可能是由于毛冬青叶黄酮类化合物在高浓度的提取介质中溶解度下降，因此提取率也随之下降。所以，选用60%的乙醇溶液为提取剂。

2.2.2 料液比对总黄酮提取的影响

准确称量5份干燥的毛冬青叶2.000 g，用浓度为60%的乙醇溶液为提取溶剂，加入不同梯度的料液比，即料液比为 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL），60℃下回流提取2 h，抽滤后定容到相应体积，然后按亚硝酸钠-硝酸铝显色方法显色，用可见分光光度计测定不同料液比下提取的毛冬青叶总黄酮的吸光度值，即得到毛冬青叶总黄酮提取率受料液比影响的关系见图3。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3 The effect of ratio of material to solvent on the extracting ratio of flavonoids

由图3可知，不同的料液比对提取率有很大影响，在低料液比的提取介质（乙醇）中，随着料液比的加大，原料中的总黄酮提取率逐渐升高；当料液比到达为1∶60（g/mL）时，随着料液比的升高，原料中的总黄酮提取率缓慢下降。这种结果也许是当溶剂加多的过程中，提取液中黄酮被加入的溶液稀释，导致其浓度降低，使得毛冬青叶中黄酮浸出，从而总黄酮的提取率增加。当达到料液比为1∶60（g/mL）后，由于提取液中总黄酮的浓度不是毛冬青叶中总黄酮的浸出主要影响因素，所以结合经济效益，选用料液比为1∶60（g/mL）较为合算。

2.2.3 提取温度对总黄酮提取的影响

准确称量5份干燥的毛冬青叶2.000 g，用浓度为60%的溶液乙醇为提取剂，加入的料液比是1∶60（g/mL），分别在 40、50、60、70、80 ℃的温度下提取 2 h，抽滤后定容到相应体积，然后按亚硝酸钠-硝酸铝显色方法显色，用可见分光光度计测量不同的料液比下提取的毛冬青叶提取物的吸光度值，即得到提取液中总黄酮的含量受加热温度的影响关系见图4。

由图4可知，加热的温度对毛冬青叶中总黄酮的提取有较大的影响，当加热温度低于50℃时，由于加热温度的增高，加快了分子浸出的速率，从而提取液中的黄酮含量增加；当温度为50℃时，提取液中的黄酮含量最高；当加热温度超过50℃后，由于提取体系温度的增加，浸出的黄酮被氧化或被高温破坏掉，导致提取体系中总黄酮量降低，而加热会使提取介质量减少，提取液中总黄酮浓度增加，使得毛冬青叶中黄酮难浸出，因此也会使其提取率降低。因此选用温度为50℃为提取温度。

图4 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of extracting temperature on the extracting ratio of flavonoids

2.2.4 提取时间对总黄酮提取率的影响

精确称量5份干燥的毛冬青叶2.000 g，用浓度为60%的乙醇溶液为提取剂，加入提取剂的料液比是1 ∶60（g/mL），在 60℃的温度下回流提取，分别提取 2、3、4、5、6 h，抽滤后定容到相应体积，然后按亚硝酸钠-硝酸铝显色法显色，用可见分光光度计测量不同加热时间下毛冬青叶提取液的吸光度值，即得到加热时间对其提取率的影响关系，结果见图5。

图5 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.5 The effect of extracting time on the extracting ratio of flavonoids

由图5可知，加热时间对于毛冬青叶总黄酮的提取率存在一定的影响，在加热时间小于4 h时，随着加热时间的增长，提取液中的总黄酮提取率逐步升高，原因可能是因为在此时间段内，黄酮不断地从毛冬青叶中浸出，从而其提取率逐步升高；当加热时间为4 h时，黄酮的提取率达到最高值，为14.22%；在加热4 h后，其提取率逐步降低，也许是由于提取液被长时间加热导致其中的黄酮被氧化或分解。但是加热时消耗巨大能量的过程，综合经济考虑，选用提取时间为4 h为最经济的提取时间。

2.2.5 正交试验优化毛冬青叶总黄酮提取工艺条件

依据上述单因素试验的结果可知，从提取液浓度、料液比、提取时间和提取温度4个因素中，找出最优因素和相邻的两组试验条件进行正交试验，确定正交试验的因素水平的选取见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

根据表1确定的因素水平，考察单因素间的相互交叉影响，准确称量干燥的毛冬青叶2.000 g，分别进行正交优化试验，得到总黄酮的提取率，结果见表2。

由表6结果可知，提取介质浓度和料液比在毛冬青叶总黄酮的提取中有很大影响，而提取时间和提取温度对其总黄酮的提取影响较小。由极差R分析可知，对黄酮提取率的影响次序为料液比＞乙醇浓度=提取时间＞提取温度，优化后最好的提取工艺为A2B2C2D1。即提取介质（乙醇）浓度为60%、料液比为1∶60（g/mL）、提取时间为5 h、提取温度为50℃。通过试验验证，在此提取条件下总黄酮的提取率最高为15.08%。

2.3 毛冬青叶总黄酮的抗氧化性研究

2.3.1 毛冬青总黄酮清除羟基自由基（·OH）试验

毛冬青总黄酮对·OH的清除作用，以芦丁作对照，试验结果见图6。

图6 不同浓度试样对·OH清除率的影响Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of different samples

毛冬青叶总黄酮具有一定的抗氧化作用，由曲线可知，在浓度升高得过程中，其对于·OH的清除作用逐步增加。在与芦丁标准液的对比中可以看出，不同浓度的样液对于·OH的清除作用的变化规律是相似的，样液对于·OH的清除率最大值为45.96%。因此，毛冬青叶中的总黄酮对于·OH的清除有很好的效果。

2.3.2 毛冬青总黄酮清除DPPH自由基（DPPH·）试验

毛冬青总黄酮对DPPH·的清除作用，以芦丁做对照，试验结果见图7。

图7 不同浓度试样对DPPH·清除率的影响Fig.7 DPPH radical scavenging rates of different samples

在较低浓度时，样液对DPPH·有很高的清除率，且清除效果与标准液的清除效果具有相似的上升变化趋势，因此，样液具有一定的抗氧化性能。在试验浓度范围内，样液对于DPPH·的清除率的最大值为83.33%。

3 结论

本试验结合乙醇回流热提法探讨提取介质浓度、料液比、加热时间、加热温度对黄酮提取工艺影响，并对毛冬青叶总黄酮的抗氧化性能做初步讨论研究。由试验得出结论：毛冬青叶中含黄酮类抗氧化成分，且最佳浸提工艺要求下总黄酮提取率为15.08%。在试验浓度范围内，该总黄酮提取液对·OH与DPPH·的清除率分别达到45.96%和83.33%，具备一定的清除自由基作用。

毛冬青叶中的黄酮类化合物具有一定抗氧化性能。毛冬青是我国南方分布广泛的林叶资源，其含有的黄酮类物质在抗氧化性能方面具有很好的生物活性，为研发新药提供了有利的开发条件，同时对于提高毛冬青的经济效益，充分利用毛冬青资源具有重要意义。