E-cadherin、β-catenin、MLCK在高甘油三酯血症相关性急性胰腺炎早期大鼠模型中的表达及意义

韦宇乐， 唐国都， 梁志海， 覃蒙斌， 符洪宗， 覃凌燕， 韦珍平

1.广西医科大学第一附属医院消化内科，广西 南宁 530021； 2.广西医科大学第二附属医院消化内科

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是消化系统疾病常见的严重急腹症之一，重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)起病凶险且伴有多种并发症，可引起胰外多器官的严重损伤而致功能衰竭[1]。AP以胆源性、酒精性为主，近年来以甘油三酯(triglyceride，TG)升高为主的高甘油三酯血症相关性急性胰腺炎(hypertriglyceridemia associated acute pancreatitis，HTGP)的发病率逐渐增加，并具有病情严重、病程发展快及反复发作等临床特点。上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)是在钙离子参与下维持上皮细胞极性和细胞间黏附的重要组成部分，β-连环蛋白(β-catenin)以高亲和力结合E-cadherin的C末端，α-连环蛋白(α-catenin)通过β-catenin与E-cadherin间接结合形成E-cadherin/catenin复合体[2]。E-cadherin及β-catenin表达上调对细胞间完整性具有一定的保护作用，表达下调或缺失时细胞间的相互黏附力减弱。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)通过使肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化，诱导肌球蛋白收缩，在维持细胞间黏附、紧密连接及屏障功能中起重要作用[3-4]。本研究通过建立高脂血症与非高脂血症的大鼠急性坏死性胰腺炎模型，观察胰腺病理变化，采用免疫组化方法检测胰腺组织中E-cadherin、β-catenin、MLCK蛋白的表达，探讨甘油三酯对急性坏死性胰腺炎早期大鼠E-cadherin、β-catenin、MLCK表达的影响，研究HTGP早期发病的特性。

1 材料与方法

1.1材料体质量为60～80 g的SPF级雄性SD健康大鼠144只，4周龄，购自广西医科大学实验动物中心，动物许可证：SCXK(桂)2014-002；胆固醇(广州威佳公司)，胆酸钠(广州威佳公司)，猪油(自制)，普通饲料(北京科奥协力有限公司)，牛黄胆酸钠(日本TCI公司)，全自动生化检测仪(7600-120型，日本HI-TACHI公司)，通用型SP-9000免疫组织化学试剂盒、DAB 试剂盒(北京中杉金桥公司)，E-cadherin、β-catenin抗体(CST公司)，MLCK抗体(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1 实验动物分组及造模：144只雄性SD大鼠随机分为普通饲料组(48只)和高脂饲料组(96只)，分别用普通饲料、高脂饲料喂养4周，满4周时行眼球眶后静脉丛采血测血清TG水平。高脂饲料配方：82.8%普通饲料+15%猪油+2%胆固醇+0.2%胆酸钠。普通饲料组分为正常组(N组)、急性坏死性胰腺炎组(ANP组)，高脂饲料组分为高脂组(HTG组)、HTGP组，高脂干预组(HTG+ML-7组)、HTGP干预组(HTGP+ML-7组)。建模前禁食12 h，自由饮水，N组、HTG组、HTG+ML-7组仅开腹轻轻翻动十二指肠，ANP组、HTGP组、HTGP+ML-7组采用经十二指肠乳头逆行胆胰管注射质量浓度为40 g/L的牛磺胆酸钠(1 ml/kg)的方法制备大鼠急性坏死性胰腺炎模型。HTG+ML-7组及HTGP+ML-7组分别在术前24、12、1 h腹腔注射2 mg/kg ML-7(溶于20 ml/L乙醇中)进行干预。各组造模后3、6、12 h处置大鼠，观察胰腺大体情况，取胰腺组织于质量浓度为100 g/L的中性甲醛固定。造模过程中，假手术组大鼠无死亡，造模组3 h无大鼠死亡，6 h时死亡1只，12 h时死亡6只，死亡大鼠由备用大鼠完成实验。

1.2.2 胰腺组织病理学检查：质量浓度为100 g/L的中性甲醛固定的胰腺组织常规行石蜡包埋、切片、HE染色，根据Schmidt标准[5]从出血、坏死、水肿、炎症浸润4个方面双盲进行胰腺病理评分。

1.2.3 胰腺组织E-cadherin、β-catenin、MLCK表达量检测：胰腺石蜡切片经脱蜡、水化，用枸橼酸钠溶液(pH=6.0)高压修复5 min后，采用链菌素亲生物素-过氧化物酶(streptavidinperoxdaseconjugataedme-thod，SP法)免疫组织化学方法，E-cadherin(CST，1∶50)、β-catenin(CST，1∶50)、MLCK(Abcam，1∶2 000)一抗4 ℃孵育过夜，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察胰腺组织的染色强度及范围。采用双盲法评分，每张切片选取5个随机高倍视野(400倍镜下)，应用Image-Pro Plus软件分析平均光密度值(IOD)。

2 结果

2.1血清TG水平普通饲料组血清呈清亮淡黄色，高脂饲料组血清呈混浊乳糜样；普通饲料组和高脂饲料组的TG含量分别为(0.41±0.10) mmol/L、(2.11±0.53) mmol/L，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2血清AMY水平ANP、HTGP、HTGP+ML-7组各时点血清AMY水平较N组、HTG、HTG+ML-7组升高(P<0.05)，同时点ANP、HTGP、HTGP+ML-7血清AMY相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 大鼠血清AMY水平Tab 1 The level of serum amylase in each group U/L

注：与N组比较，aP<0.05；与HTG组比较，bP<0.05；与HTG+ML-7组比较，cP<0.05。

2.3血清Ca2+水平造模后6 h，ANP组与HTGP组血清Ca2+分别低于N组和HTG组(P<0.05)，HTGP+ML-7组12 h时血清Ca2+较HTG+ML-7组下降(P<0.05)。同时点ANP、HTGP、HTGP+ML-7组血清Ca2+比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠血清Ca2+水平Tab 2 The level of serum Ca2+ in each group mmol/L

注：与N组比较，aP<0.05；与HTG组比较，bP<0.05；与HTG+ML-7组比较，cP<0.05。

2.4胰腺组织病理学改变N组胰腺组织镜下无明显病理改变；HTG组、HTG+ML-7组偶见部分胰腺组织轻度小叶间水肿，少量炎性细胞浸润，未见出血和腺泡细胞坏死；ANP、HTGP、HTGP+ML-7组各时间点胰腺呈现不同程度水肿、出血、坏死、炎性细胞浸润，并随着时间延长胰腺坏死程度加重，腺泡细胞大面积坏死，细胞内出现明显的空泡，大量炎症细胞浸润，腺泡结构破坏(见图1)。随着病程发展，胰腺组织病理学评分逐渐升高，各组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。同时点HTGP组病理评分较ANP组显著升高(P<0.05)，HTGP+ML-7组病理评分较HTGP组改善(P<0.05)，与ANP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表3、图1)。

表3 各组大鼠胰腺病理评分

注：与N组比较，aP<0.05；与HTG组比较，bP<0.05；与HTG+ML-7组比较，cP<0.05；与ANP组比较，dP<0.05；与HTGP比较，eP<0.05。

2.5E-cadherin、β-catenin、MLCK在各组胰腺组织中的表达结果E-cadherin、β-catenin主要表达在细胞膜及细胞质中，呈棕黄色染色。E-cadherin、β-catenin在N组无明显表达，在HTG组和HTG+ML-7组可见细胞质少量蓄积。在各时点ANP组、HTGP组、HTGP+ML-7组中均可见随着病情的发展E-cadherin、β-catenin在细胞膜和细胞质表达增强，同时点HTGP组比ANP组表达明显升高(P<0.05)，HTGP+ML-7组较HTGP组表达减少(P<0.05)，与ANP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表4～5、图2～3)。MLCK主要表达于胰腺导管上皮细胞及腺泡细胞，呈棕黄色染色。与各时点相比HTGP组大鼠胰腺组织MLCK的表达量较ANP组明显升高(P<0.05)，与HTGP+ML-7组比较，HTGP组表达减少(P<0.05)，与ANP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表6、图4)。E-cadherin、β-catenin、MLCK分别与胰腺病理评分呈正相关(r1=0.644，r2=0.474，r3=0.685,P均<0.05)。

图1 各组大鼠3、6、12 h时胰腺组织病理改变(HE 200×) Fig 1 Pancreatic histopathological changes of rats in each group at 3, 6, 12 hours (HE 200×)

图2 各组大鼠3、6、12 h时胰腺组织免疫组化法检测E-cadherin蛋白(400×) Fig 2 The E-cadherin protein in pancreatic tissues of rats in each group detected by immunohistochemistry at 3, 6, 12 hours (400×)

表4 各组胰腺组织免疫组织化学法E-cadherin蛋白表达Tab 4 The expression of E-cadherin protein in pancreastic tissues detected by immunohistochemistory in each group

注：与N组比较，aP<0.05；与HTG组比较，bP<0.05；与HTG+ML-7组比较，cP<0.05；与ANP组比较，dP<0.05；与HTGP组比较，eP<0.05。

表5 各组胰腺组织免疫组织化学法β-catenin蛋白表达Tab 5 The expression of β-catenin protein in pancreatic tissues detected by immunohistochemistory in each group

注：与N组比较，aP<0.05；与HTG组比较，bP<0.05；与HTG+ML-7组比较，cP<0.05；与ANP组比较，dP<0.05；与HTGP组比较，eP<0.05。

表6 各组胰腺组织免疫组织化学法MLCK蛋白表达Tab 6 The expression of MLCK protein in pancreastic tissues detected by immunohistochemistory in each group

注：与N组比较，aP<0.05；与HTG组比较，bP<0.05；与HTG+ML-7组比较，cP<0.05；与ANP组比较，dP<0.05；与HTGP组比较，eP<0.05。

3 讨论

AP是多种病因导致的胰酶激活、自身消化所引起的一系列化学炎性反应。KLATSKIN等[6]于1952年首次报道复发性胰腺炎和高脂血症同时发生时，高脂血症可能是导致胰腺炎反复发作的原因，此后高脂血症与胰腺炎的相关性引起临床上的广泛关注。近年来HTGP的发病率逐渐上升，已成为继胆源性、酒精性之后AP的第三大病因，具有病情严重、病程发展快及反复发作等临床特点。目前主要围绕的几种发病机制为：(1)游离脂肪酸对组织腺泡细胞直接损伤假设；(2)胰蛋白酶原激活加速假设；(3)胰腺微循环障碍假设；(4)氧化应激反应；(5)钙超载。研究[7-9]表明，HTGP淀粉酶升高较胆源性急性胰腺炎低，即使影像学提示胰腺病变严重，血清淀粉酶可以是正常范围或升高不明显。本研究结果显示，同时点HTGP组胰腺病理损伤程度较ANP组明显增高，提示HTG可加重ANP的严重程度。各时点HTGP组血淀粉酶水平与ANP组相比无明显差异，除与HTGP组胰腺组织坏死严重淀粉酶释放减少有关，还可能与血浆中存在抑制血淀粉酶活性的因子有关。

图3 各组大鼠3、6、12 h胰腺组织免疫组化法检测β-catenin蛋白(400×) Fig 3 The β-catenin protein in pancreatic tissues of rats detected by immunohistochemistry in each group at 3, 6, 12 hours (400×)

E-cadherin属于钙依赖性细胞黏附分子，是介导上皮细胞间黏附的重要黏附分子，可促进相邻细胞形成稳定的细胞间连接，维持组织结构和功能的完整。β-catenin以高亲和力结合E-cadherin的C末端，α-catenin通过β-catenin间接结合形成E-cadherin/catenin复合体并对该复合体具有重要调节作用。当β-catenin受到蛋白酪氨酸激酶磷酸化后可导致E-cadherin/catenin复合体失去连接，细胞黏附功能丧失，细胞间连接松散脱落[2,6,10-11]。上调E-cadherin和β-catenin的表达及稳定E-cadherin/β-catenin 复合体可以增强上皮细胞屏障功能[12]，抑制肿瘤细胞侵袭、转移能力[13-14]。在本研究中，造模后3、6、12 h免疫组化结果显示，ANP组和HTGP组E-cadherin、β-catenin水平上调，并随着炎症加重升高明显，同时点HTGP组上调水平显著高于ANP组，提示急性坏死性胰腺炎早期E-cadherin和β-catenin可能通过自我增殖促进损伤后连接结构重建，且HTGP组再黏附的过程强于ANP组，细胞间连接受损严重。

图4 各组大鼠3、6、12 h胰腺组织免疫组化法检测MLCK蛋白表达(400×) Fig 4 The expression of MLCK protein in pancreatic tissues of rats detected by immunohistochemistry in each group

肌球蛋白轻链激酶MLCK是平滑肌细胞收缩的关键调节蛋白，主要由mylk1和mylk2两种基因编码[15]。MLCK的结构组成包括N端肌动蛋白结合区、中心激酶区、钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合区及C端的肌球蛋白结合区。细胞收缩、黏附、迁移和上皮屏障形成与肌球蛋白调节轻链(myosin light chain，MLC) 磷酸化有关。Ca2+和CaM结合后激活MLCK[16]，进而磷酸化MLC Ser19和Thr18，促使肌动蛋白收缩引起细胞骨架重排及增加细胞表面张力，开放细胞间隙，使细胞间通透性增加[3-4]。LORENTZ等[17]表明，患有脓毒血症的MLCK-/-小鼠与WT小鼠相比死亡率明显下降，肠黏膜ZO-1和claudin 15表达升高肠屏障功能得到改善。EUTAMENE等[18]表明，MLCK抑制剂ML-7可能通过降低MLCK磷酸化和Rho/Rho激酶水平减少肌动蛋白重排，从而影响细胞间紧密连接功能。石慧荣等[19]实验表明，在重症急性胰腺炎中MLCK可能对细胞超微结构及TJ结构的完整性进行调控，引起细胞紧密连接破坏和肠屏障功能损伤。本研究中HTGP组MLCK表达较ANP组显著，与病理损伤趋势一致。HTGP组E-cadherin和β-catenin表达较ANP组明显，利用ML-7干预后二者表达下降，且病理损伤得到改善。ML-7抑制剂MLCK可降低HTGP上皮细胞黏附连接蛋白水平，改善胰腺病理损伤，表明MLCK可能通过改变细胞间连接参与了HTGP的发生、发展。

综上所述，E-cadherin、β-catenin及MLCK在急性坏死性胰腺炎早期表达上调，三者表达同时点HTGP较ANP升高明显，且与疾病的严重程度有关，MLCK可能通过调节细胞间黏附连接参与HTGP的形成。