耐低温玉米自交系的筛选及其叶片生理特性和细胞结构变化

李 波，方志坚

(齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院/抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室,黑龙江 齐齐哈尔 161006)

玉米是东北地区种植的主要作物，其播种面积和总产量均较高[1]。早春低温冷害形成该区域特有的生态气候条件，对作物种子生活力产生不良影响[2]。玉米是温度敏感型作物，对温度条件要求较高，耐受冷害能力较弱。因此，北方玉米种植区玉米产量不可避免地受到春播低温的影响[3-4]。近年来，关于玉米低温冷害以及缓解低温冷害对玉米生产的影响方面已有研究。低温胁迫的玉米植株，叶片光合系统受到抑制，植株的正常生长发育受到影响[5-6]。针对玉米遭遇低温冷害的现象，可以通过加入适宜浓度的外源物质[7]、喷施冠菌素(COR)[8]、加入外源脯氨酸(Pro)和甜菜碱(GB)[9]等方法进行缓解。但以往这些研究主要集中在不同品种玉米种子萌发、幼苗生长和生理生化方面。在玉米不同的生长阶段，低温对营养生长和生殖生长均产生不同程度的影响[10]，因低温引起玉米叶片超微结构变化的相关研究鲜见报道。另外，选育耐冷性较强的品种或自交系，探索提高玉米种子抗(耐)冷能力的技术体系，是应对早春低温冷害的有效措施。不同品种对低温的耐受能力不同，其幼苗生理特性往往不同。鉴于此，研究了不同玉米自交系幼苗的耐低温能力，并对耐低温能力不同的玉米自交系的抗逆生理特性进行初步探讨，以筛选适宜东北地区春季早播的耐低温玉米自交系，同时为培育耐低温玉米新品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以黑龙江省畜牧研究所提供的91份玉米自选自交系种子为材料，具体编号和名称见表1。

表1 玉米自交系材料及编号

1.2 试验方法

1.2.1 低温处理 采用0.1% HgCl2对玉米种子进行消毒，然后均匀播种在装有营养土的营养钵内，每天定期观察和统计出苗率，待幼苗长到3叶1心期，将部分幼苗移入培养箱进行低温处理：3 ℃处理5 d，3次重复，每次重复20株幼苗，之后在25 ℃人工气候箱中恢复生长3 d后，计算其相对存活率，并根据相对存活率对玉米自交系的耐低温等级进行分类。

选择不同耐低温等级玉米自交系种子6份，在装有营养土的营养钵内培养至3叶1心期后，移入7 ℃培养箱中进行低温处理，25 ℃人工气候箱恢复生长3 d，选取功能叶片用于生理生化指标测定和透射电镜切片的制作。

1.2.2 生理生化指标测定 对不同耐低温等级的玉米自交系幼苗进行8项生理指标的测定[11]：可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，可溶性糖、丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量测定采用茚三酮法，相对电导率测定采用电导法，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚比色法，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑光化还原法，各指标测定均重复3次。

1.2.3 透射电镜切片的制作 选择耐低温能力强弱不同的2个自交系，取幼苗叶片(3叶1心期中间叶片)中部，切割成2～4 mm小块→2.5%戊二醛固定2 h→0.1 mol/L磷酸液冲洗30 min→2%四氧化锇固定2 h→蒸馏水冲洗30 min→30%、50%、70%、80%乙醇4 ℃脱水各15 min→90%、95%乙醇室温各15 min→100%乙醇和100%环氧丙烷室温各20 min→环氧丙烷和环氧树脂3∶1、1∶1、1∶3分别渗透1 h、2 h、2 h→60 ℃恒温箱聚合36 h→1 μm半薄切片→醋酸双氧铀染色30 min→超薄切片→日立H-7650型透射电镜观察和拍照。

1.3 数据处理与分析

利用分析软件Excel 2003、SPSS 17.0对所测指标数据进行方差分析，比较8项生理生化指标的差异及其显著性。

通过8项指标的低温处理与对照的测定值计算抗寒系数，再利用抗寒系数计算隶属值，应用隶属函数法对玉米自交系抗逆性进行综合评价[12-13]。

抗寒系数=低温处理测定值/对照测定值；

隶属函数值计算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；反隶属函数值计算公式：R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；式中，Xi为指标测定值，Xmin、Xmax分别为某项指标的最小值和最大值。将耐低温能力隶属值进行累加求出平均数：X=ΣU(Xi)/n，X为所求平均抗性的隶属值。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对玉米自交系幼苗相对存活率的影响

由图1可见，91份玉米自交系幼苗在3 ℃低温处理后相对存活率差异极大，在同一低温胁迫处理下，相对存活率最高为83.33%，最低为0。依据低温胁迫下玉米幼苗的相对存活率，对91份玉米自交系的耐低温等级进行分类，共分6级(表2)，其中，11号自交系幼苗相对存活率为83.33%，为91份材料中耐低温能力极强的自交系；其次为12、16、33、34、36、83号自交系，对低温有强耐性，幼苗相对存活率分别为78.57%、74.07%、75.86%、71.43%、72.00%、62.96%；耐低温能力中强的自交系7份，分别为5、8、35、41、42、78、81号自交系，幼苗相对存活率分别为50.00%、50.00%、50.00%、45.45%、41.18%、46.15%、41.6%。此3类玉米自交系共14个，耐低温能力较强，占供试自交系的15.38%；其他自交系幼苗相对存活率均低于50%，且91份材料中有45份自交系幼苗相对存活率为0，占49.45%，为不耐低温的自交系。

图1 低温胁迫下玉米自交系幼苗的相对存活率

耐低温等级相对存活率/%材料数/份自交系编号极强100～80111强79～60612、16、33、34、36、83中强59～4075、8、35、41、42、78、81 弱39～1322、3、4、6、7、9、10、13、18、20、21、22、24、25、26、29、30、32、44、47、48、50、52、53、56、57、60、66、68、70、80、89不耐0451、14、15、17、19、23、27、28、31、37、38、39、40、43、45、46、49、51、54、55、58、59、61、62、63、64、65、67、69、71、72、73、74、75、76、77、79、82、84、85、86、87、88、90、91

根据表1中的耐低温等级分类结果，选择6份耐低温等级不同的玉米自交系，分别为11、33、35、6、1、46号自交系，经7 ℃低温胁迫后，比较幼苗叶片的生理特性差异。

2.2 不同耐低温等级玉米自交系的生理特性及其耐低温综合评价

2.2.1 可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量 由图2可见，低温胁迫下6份玉米自交系幼苗叶片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量均有不同程度的增加，46、1、35、6、33、11号自交系的可溶性糖含量分别为对照的1.29、1.09、1.41、1.27、1.52、1.45倍，且以11号自交系的可溶性糖含量最多；可溶性蛋白含量分别为对照的1.17、1.28、1.41、1.24、1.51、1.47倍，且以33号自交系可溶性蛋白含量最多；脯氨酸含量分别为对照的1.11、1.29、1.35、1.30、1.43、1.51倍，脯氨酸积累量最多的为11号自交系。可见，低温胁迫促进玉米自交系可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的积累，但不同耐低温等级玉米自交系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸积累程度不同，耐低温能力强的自交系3种渗透调节物质含量增幅加大。

不同小写字母表示同一处理下不同自交系在0.05水平上差异显著，下同

2.2.2 MDA含量和相对电导率 MDA含量和相对电导率的变化反映低温对膜引起的膜脂过氧化作用。由图3可见，低温胁迫下，46、1、35、6、33、11号玉米自交系幼苗叶片的相对电导率分别为对照的1.19、1.29、1.10、1.12、1.11、1.10倍，MDA含量分别为对照的1.37、1.45、1.32、1.24、1.21、1.23倍，其中，以11号玉米自交系的相对电导率和MDA含量最低。从MDA含量和相对电导率的变化分析，耐低温能力强的玉米自交系叶片细胞膜的损伤比较小，而耐低温能力差的自交系叶片细胞膜损伤比较大。

图3 低温胁迫下玉米自交系幼苗的MDA含量和相对电导率

2.2.3 POD、CAT、SOD活性 由图4可见，低温胁迫提高了46、1、35、6、33、11号玉米自交系的3种抗氧化酶活性，POD活性分别为对照的1.29、1.28、1.56、1.38、1.79、1.64倍，CAT活性分别为对照的1.31、1.59、1.67、1.52、2.13、1.79倍，SOD活性分别为对照的1.15、1.11、1.24、1.43、1.45、1.96倍，且POD、CAT、SOD活性均以11号自交系最高。不同耐低温等级自交系通过促进这3种抗氧化酶活性的增加，来抵御低温对幼苗的伤害，耐低温能力强的自交系3种抗氧化酶活性均较高。

图4 低温胁迫下玉米自交系幼苗的POD、CAT、SOD活性

2.2.4 耐低温综合评价 对上述8项生理指标进行抗寒系数和隶属值的计算，避免单个指标出现的偶然性。根据抗寒系数(表3)计算各指标的隶属值(表4)。分析排序后的综合评价值，综合隶属值越大，其耐低温能力越强。6份玉米自交系耐低温能力强弱为：11>33>35>6>46>1。

表3 6份玉米自交系幼苗8项生理指标的抗寒系数

表4 6份玉米自交系幼苗8项生理指标的隶属值

2.3 低温胁迫对玉米自交系叶片超微结构的影响

叶绿体是光合作用的场所，其内基粒整齐垛叠在一起，膜面积越大，光合能力越强。低温等逆境胁迫对玉米自交系细胞超微结构具有一定的影响。逆境胁迫下，叶绿体结构受损，基粒溶解，基粒片层结构解体，细胞膜受损，造成光合作用受阻，细胞膜受损，细胞代谢紊乱，从而影响作物的正常生长。由于受自交系幼苗低温胁迫功能叶片和种子数量的限制，选择耐低温能力强(33号)和弱(46号)自交系，观测叶片超微结构(图5)，对照玉米自交系叶片的细胞结构较为规则，叶绿体外膜清晰，内部基粒片层排列整齐，叶绿体内含有大量淀粉粒，部分叶绿体互相靠近，联合在一起。线粒体均匀分布在细胞边缘，呈椭圆形，双层膜结构完整，内部嵴较丰富；低温胁迫处理的玉米自交系叶片细胞结构均发生不同程度的改变，主要体现在相邻细胞间隙变大，叶绿体内部结构被破坏，淀粉粒数量增加，出现巨型淀粉粒、类囊体膜膨胀疏松、基粒消失、叶肉细胞整体变大等现象。耐低温能力强的玉米自交系叶片结构变化较小，但也出现轻微的质壁分离现象，叶绿体结构比较完整，叶绿体外膜清晰，内部基质片层排列整齐并含有大量淀粉粒。耐低温能力弱的玉米自交系叶片细胞结构变化较大，细胞严重变形，质壁分离严重，叶绿体膜遭到破坏，局部破裂，基质外渗，叶绿体中淀粉粒大量增加，内部基质片层排列混乱，基质空间增大，基粒类囊体膨胀，发生扭曲等现象。

A和E分别为46号自交系低温处理和对照的叶片细胞(2 500×)，B和F分别为46号自交系低温处理和对照的叶片细胞间隙(5 000×)，K和P分别为46号自交系低温处理和对照的叶绿体结构(10 000×)，L和Q分别为46号自交系低温处理和对照的叶绿体结构(20 000×)；C和G分别为33号自交系低温处理和对照的叶片细胞(2 500×)，D和H分别为33号自交系低温处理和对照的叶片细胞间隙(5 000×)，M和R分别为33号自交系低温处理和对照的叶绿体结构(10 000×)，N和S分别为33号自交系低温处理和对照的叶绿体结构(20 000×)；CW.细胞壁； Chl.叶绿体； GL.基粒片层； SL.基质片层； OG.嗜锇颗粒； SG.淀粉粒； CM.叶绿体膜； Cr.嵴

3 结论与讨论

3.1 低温对玉米叶片渗透调节、膜透性和抗氧化能力的影响

植物在逆境环境下通过主动积累各种有机物来提高细胞液浓度，降低细胞渗透势，提高细胞保水力，以适应逆境胁迫的影响[14-16]。细胞内合成的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等多种有机物质是植物体内最有效的渗透调节物质。相关研究表明，低温胁迫下，植物体内的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量增加[17]，从而增强植物的抗逆境能力。本研究结果显示，抗性强的玉米自交系较抗性差的自交系积累更多的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，从而增强耐低温能力。在所选择的6份耐低温能力不同的玉米自交系中，耐性强的自交系农M6和WM40-2在低温胁迫下这3种渗透调节物质积累更多。

植物在受到逆境胁迫时，膜透性发生改变，MDA含量和相对电导率增加[18-19]。因此，MDA含量和相对电导率的高低与细胞膜的伤害程度呈正相关。低温能改变玉米幼苗叶片细胞的通透性，其变化大小受外界低温强度和作用时间长短以及不同品种耐低温能力不同影响。温度越低，细胞膜损伤越严重，细胞膜透性越大。本研究中，低温条件下，耐低温能力强的玉米自交系农M6和WM40-2渗透率较低，质膜相对稳定。

植物的低温胁迫抗性与活性氧清除能力密切相关[20]，植物抗氧化酶活性大幅度增加可缓解活性氧带来的伤害，提高植物抗逆性。玉米幼苗在低温胁迫下抗氧化酶系统发生改变，不同自交系耐低温能力不同的部分原因是其抗氧化酶系统的差异，因此，低温胁迫下SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性的变化可作为筛选玉米耐低温自交系的重要指标，本研究中，耐低温能力强的玉米自交系这3种酶活性均较高。

为减少材料遗传背景不同引起的误差，真实地反映材料的耐低温特性，通常采用多个性状低温下与常温下的相对值作为评价指标，避免应用单一指标评价材料的耐低温能力。试验选择6份不同耐低温等级的玉米自交系幼苗，通过分析可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、MDA含量，相对电导率，POD、CAT、SOD活性8项生理生化指标的隶属值，得出6份玉米自交系的耐低温能力强弱为农M6>A15>A46>C3-3>南引37>泽玉119-1，与玉米幼苗相对存活率的耐低温评价等级一致。

3.2 低温对玉米叶片细胞结构的影响

逆境对植物细胞结构产生不同程度的影响[21]。试验发现，低温胁迫对玉米自交系叶片超微结构的影响主要体现在细胞形态和叶绿体结构上，表现为叶绿体紧贴细胞壁分布，细胞间出现了轻微质壁分离，叶绿体内基粒杂乱无章，内部其他片层的形成使类囊体片层发育受到阻碍，基粒垛叠不紧，内部结构发生改变，同时生成了大量淀粉粒，这与王雪英等[22]的研究结果相似。低温胁迫导致叶片细胞叶绿体内含出现大量淀粉粒，是因为低温影响了光合产物淀粉粒的运输，光合速率降低；同时，低温胁迫下嗜锇颗粒明显多于对照，可以保持质膜稳定，影响植物抗逆性。低温不仅增加淀粉粒数目，而且使淀粉粒变圆膨胀，当淀粉粒体积增大到一定程度时，对类囊体造成损伤，最终叶绿体膜胀破，叶绿体解体，叶片失去光合作用的能力，从而影响植株的正常生长，这与周勇辉等[23]和Li等[24]的研究结果相似。

综上，低温胁迫下，根据玉米相对幼苗存活率筛选所得耐低温能力强的自交系为农M6、WM40-2、C11-3、A15、A44、吉846/KL4-5、03-391。该类自交系在低温下可积累较多的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸， 且POD、CAT、SOD活性提高，以降低对膜的伤害；同时其叶片超微结构上变化较小。因此，生产上可以选择耐低温能力强的玉米自交系进行配合，以提高玉米的耐低温能力。