响应面法优化垂盆草中总黄酮提取工艺的研究

韩涛　王瑞　马俊杰　郑贲　李长江

【摘 要】本文考查垂盆草中总黄酮的溶剂浸提工艺，以芦丁为标准品，采用响应面（Box-Behnken）设计方法，对提取时间、温度、料液比进行优化，结果：提取时间为60 min，以50℃为提取温度，垂盆草与乙醇（76.8 %）料液比为1：15时，提取垂盆草中总黄酮的工艺最佳，总黄酮得率为17.1814 mg/g。实验结果与模型预测值相符度高。

【关键词】垂盆草；响应面法；总黄酮；提取工艺

中图分类号： R284.2 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）15-0026-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.15.012

Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Sedum

Sarmentosum Bunge by Response Surface Methodology

HAN Tao WANG Rui MA Jun-jie ZHENG Ben LI Chang-jiang*

（College of Chemistry and Chemical Engineering， Huangshan University， Anhui， Huangshang， 245041）

【Abstract】To optunize the extraction technology of total flavonoids from Sedum sarmentosum Bunge. The factors such as extraction temperature， material-liquid ratio and ethanol concentration were optimized by response surface methodology. The results show that the Box-Behnken design method is reliable.The highest extraction rate of total flavonoids by extraction could arrive at 17.1814 mg/g using extraction temperature 50 ℃， material-liquid ratio of 1：15， 76.8 % ethanol concentration， and extraction time 60 min， which was agreed with model predictions.

【Key words】Sedum sarmentosum Bunge；Response surface method；Total flavonoids；Extraction process

垂盆草为景天科植物，是一种具有观赏性的中草药，收录在《中国药典》2015 年版一部，利湿退黄、清热解毒； 用于治疗湿热黄疸，小便不利，痈肿疮疡，急、慢性肝炎等[1]。从化学成分角度来看，垂盆草主要成分为黄酮类、氨基酸类、糖类、蛋白质、三萜类等，研究表明这些化学组分在临床应用中有较好的生物学活性，其中垂盆草总黄酮是垂盆草中重要的保肝降酶活性成分之一[2-4]。目前对垂盆草总黄酮的种类、药理的研究很深入，但在提取工艺方面的研究还不够深入，目前研究广泛使用的是正交试验法[5-8]。本文利用响应面设计方法[9，10]优化传统的溶剂提取工艺参数，为垂盆草总黄酮类功效成分的开发利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

垂盆草购自安徽黄山同德仁药铺，芦丁标准品购自国药集团，其他试剂均购自阿拉丁试剂网。

UV-2600紫外可见分光光度计（岛津仪器苏州有限公司），FA2104B电子天平（上海越平科学仪器有限公司），XFB-1000中药粉碎机（中诚制药机械厂），移液枪（大龙兴创实验仪器有限公司）

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

配置4mg/mL的芦丁标准品溶液（准确称取芦丁标准品16.00mg，然后加入60%乙醇定容到4mL），分别移取0.75mL，0.5mL，0.25mL和0.025mL的芦丁标准品，分别用60 %的乙醇溶液将其定容到1mL，配置浓度为3mg/mL，2mg/mL，1mg/mL和0.1mg/mL的芦丁标准品溶液。用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法[11]，分别吸取0.1mg/mL，1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL的芦丁标准品各1mL加入10mL的具塞离心管中，各加入5%的NaNO2溶液0.4mL混匀后静置5min，然后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL混匀后静置5min，最后加入4%的NaOH溶液4mL，定容后混勻静置20min。用60 %的乙醇溶液做参比扫描基线，依次在最大吸收波长504nm（芦丁标准品的最大吸收波长）处下测定各标准溶液的吸光度，如图1-1，得出在504nm波长处测定吸光度，以样品浓度对吸光度进行线性回归，得到吸光度与浓度的回归方程为y=1.0701x+0.0003，R=0.9989。从标准曲线可以看出，芦丁对照品浓度在0～3mg/mL之间时与吸光度成较好的线性关系。

1.2.2 垂盆草总黄酮的提取和含量的测定

用电子天平准确称取粉碎后的垂盆草2.0000g，称取5份，分别倒入50 mL 的锥形瓶中，用不同浓度的乙醇溶液，在不同的温度下，按照一定的料液比进行提取，提取结束后静置离心，取清澈提取液，然后进行如 1.2.1 的显色处理后测得吸光度，代入回归方程，计算出总黄酮的提取率。

2 响应面设计实验结果及分析

2.1 试验设计

依照中心组合设计规律，综合响应面分析方法，考虑单因素筛选实验结果。以提取温度（A），料液比（B），乙醇浓度（C）三个因素为自变量，以–1、0、1分别代表自变量的低、中、高水平，按方程X1=（χ1-60）/10、X2=（χ2-20）/5、X3=（χ3-70）/20对自变量进行编码，以总黄酮的提取量为响应值，设计三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验，因子编码及水平见表2-1。

2.2 二次响应面回归模型的建立

采用Design-Expert 8.0.6.1软件设计试验条件，采用Box-Behnken模型[12]，对表2-2的结果进行拟合，得到总黄酮的提取量对提取温度（A），料液比（B），乙醇浓度（C）的二次多项回归方程模型：

Y=14.19+0.31A-0.49B+1.47C-O.41AB-0.36AC-0.27BC+0.63A2+0.59B2-1.34C2 （i）

2.3 响应面回归模型的方差分析

再次检验回归方程的可靠性，进一步确定因素A，B，C对总黄酮提取量的影响程度，对回归模型进行了方差分析，結果见表3-3。

观察模型的F=13.26，P<0.001，差异显著，即对总黄酮提取量的影响较为显著。可以看出该拟合方程各因素与响应值之间的关系能与回归方程很好拟合。把A，B，C带入回归方程模型，可以看到回归系数p值均小于0.05。提取温度、料液比和乙醇浓度均对提取总黄酮量有影响。

2.4 响应面分析

绘制响应面立体分析图及等高线是把因素A，B，C带入Design-Expert软件依据回归方程（i），观察拟合响应曲面的形状，结合提取条件对垂盆草总黄酮提取量的影响。分析响应面的情况。

我们知道因素的改变对响应值影响很大，观察响应曲面坡度，可以看出坡度越陡，影响越明显。而因素的改变越小，则响应面曲线越平缓 。从图2-1～2-3可以看出各显著性影响因素交互作用对响应值的影响，提取时间和料液比交互作用曲面如果越陡，表明对总黄酮提取量交互作用越明显，反之，交互作用曲面越缓，表明对总黄酮提取量交互作用越不明显。

2.5 最优条件的确定

为确定各因素的最佳取值，利用Design-Expert软件中的Optimization的Numerical功能，在模型浓度范围内选择最低点为出发点，使用最大值优化，得提取垂盆草总黄酮的理论工艺：在提取时间60min下，反应温度为50℃，垂本草和溶剂比为1：15，乙醇浓度为76.8%，得到的总黄酮的量为17.1814mg/g。为验证响应面法的可行性，采用修正的最佳提取工艺：垂本草和溶剂比为1：15，在提取时间60min，反应温度为50 ℃，乙醇浓度为75%的条件下进行优化实验，实验结果如表2-4。

从表中可以得出，该优化条件三次提取平均值偏差为1.05 %比理论值3 %小，说明实验值与理论值有较好的拟合性。

3 结论

本实验以垂盆草为原料，打磨成粉，溶剂浸提。由于黄酮类化合物的结构特征，采用乙醇为溶剂进行提。由实验结果可知，在提取温度为30℃-50℃范围内，温度升高可以加快提取总黄酮的速率，但温度超过50℃时，苷键水解和细胞内色素的溶出会影响总黄酮的提取速率。适合的料液比可以有效地溶解总黄酮，而且不会造成浪费。本实验采用响应面法优化提取总黄酮的反应条件，优化结果与试验较接近，说明应用响应面法优化提取垂盆草中总黄酮的方法是可靠的。

通过响应面分析，得到用乙醇为溶剂提取垂盆草总黄酮的最佳工艺：为垂本草与溶剂比为1：15提取时间60min，提取温度为50℃，乙醇浓度76.8%，的条件下所提取的总黄酮含量为17.1814mg/g。与单因素提取相比较，采用响应面法可以更有效的提取总黄酮，对垂盆草的研究开发具有重要意义。

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