猪戊型肝炎病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

2018-10-30赵晓静虞楷锐周天明李慧霞盛亚敏陈宜阳刘宝元孙亚妮周恩民

畜牧兽医学报 2018年10期

丁军，赵晓静，虞楷锐，周天明，李慧霞，盛亚敏，陈宜阳，刘宝元，孙亚妮，周恩民，赵钦

(西北农林科技大学动物医学院，农业部兽用药物与诊断技术陕西科学观测实验站，杨凌 712100)

戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)感染所致的一种人兽共患病，猪和野鹿可能是HEV的自然储存宿主[1]。据世界卫生组织2017年7月公布的数据，全球每年约有2 000万人感染HEV，其中约330万人出现戊肝症状，戊型肝炎在2015年造成的死亡约有4.4万例[2]。流行病学调查发现，我国多数省份有HE的暴发，且处于不断上升的趋势[3-4]，戊型肝炎感染已逐渐成为一个重要的公共卫生问题。

猪HEV是第一个动物HEV分离株，随着越来越多猪HEV分离株的鉴定，现已发现猪群中主要存在基因3和4型HEV[5-6]，而我国猪群中流行的HEV主要以基因4型为主[7]。HEV感染猪的临床症状比较温和，仅引起亚临床感染，但是，由于其人畜共感染的特性，必须做好猪群中HEV感染的监控。目前，猪HEV感染的诊断方法主要是病毒核酸的RT-PCR和血清中猪HEV抗体的ELISA检测。但是RT-PCR技术操作复杂、成本高，容易污染，而ELISA以其简易和高通量的优点被广泛使用[8-10]。此外，目前并没有任何商品化的猪HEV疫苗，因此，利用ELISA检测猪HEV抗体可以监测猪群中猪HEV感染情况。但是，目前市面上几种商品化的猪HEV ELISA试剂盒，一类使用检测人血清中HEV抗体的商品化ELISA试剂盒检测猪血清中猪HEV抗体，导致检测结果难以判定；还有一类分别采用猪HEV衣壳蛋白不同的抗原肽作为包被抗原，导致不同商品化试剂盒的检测结果符合率较低[11]。因此，急需建立一种准确性、敏感性和特异性较高的ELISA方法，为猪群中HEV感染的监控提供技术支撑。

本研究以原核表达并纯化的不含有任何标签的猪HEV衣壳蛋白C端268个氨基酸为包被抗原，通过优化ELISA条件，并评价其应用性，建立了敏感性和特异性较高的猪HEV抗体间接ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株和血清

基因4型猪源HEV CHN-SD-sHEV株分离自山东某屠宰场，GenBank登录号为KF176351。猪HEV阳性血清由本实验室通过CHN-SD-sHEV株感染HEV阴性猪制备；91份阴性血清采自HEV RNA和抗体均为阴性的猪；猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒和猪细小病毒的阳性血清均由本实验室从临床样品获得；45份猪HEV感染猪后连续不同周龄血清也由本实验室通过CHN-SD-sHEV感染阴性猪制备；477份临床猪血清采自陕西省不同地区的商品化猪场。

1.2 主要试剂

分子生物学相关试剂购自北京全式金生物技术有限公司；HRP标记的羊抗猪IgG抗体购自Sigma公司；TMB显色液购自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所；三种猪HEV抗体检测商品化试剂盒分别购自北京万泰生物药业、南京森贝伽和上海酶联生物科技有限公司。

1.3 包被抗原的制备

1.3.1 猪HEV衣壳蛋白C端268个氨基酸在大肠杆菌中的原核表达利用RT-PCR方法扩增编码猪HEV衣壳蛋白C端268个氨基酸区域的核酸序列，然后利用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切、T4连接酶连接至原核表达载体pET-21b(+)，构建重组表达质粒pET-21b-sHEV-ORF2-C。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，蛋白命名sHEV-ORF2-C。SDS-PAGE分析蛋白是否表达。

1.3.2 表达蛋白的复性和纯化将超声裂解后8 mol·L-1尿素溶解的目的蛋白置于透析袋中，将透析袋放入装有20倍以上蛋白样品体积的复性液PBS(pH 7.4)溶液的烧杯中，在4 ℃下，用磁力搅拌器中速地搅拌复性液，以加速溶液的渗透和扩散。每隔2～3 h换1次等量新鲜的复性液，重复4次。收集复性后的样品，经4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，上清即为目的蛋白的复性液。

利用AKTA Pure 25蛋白自动纯化系统和Superdex 200 increase凝胶过滤柱对复性获得的蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析蛋白纯化效果。

1.3.3 表达蛋白抗原性分析将重组载体、空载体的大肠杆菌表达产物，以及纯化的蛋白同时进行SDS-PAGE电泳,然后将蛋白质湿转，转移至PVDF膜上，利用猪HEV阳性血清为一抗，Western blot分析表达纯化的sHEV-ORF2-C蛋白的反应原性。

1.4 间接ELISA检测方法的建立

1.4.1 间接ELISA方法操作步骤将复性、纯化的蛋白sHEV-ORF2-C用包被缓冲液稀释后，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜。弃去包被液，PBST洗涤3次，加入封闭液，每孔200 μL，室温封闭1 h。PBST洗涤后，分别加入含有10%大肠杆菌裂解液的封闭液稀释的待检血清以及猪HEV阳性和阴性血清，每孔100 μL，室温孵育1 h。PBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG，每孔100 μL，室温孵育1 h。PBST洗涤后加入TMB显色液，室温显色15 min，最后加入3 mol·L-1H2SO4终止液终止反应，酶标仪测定OD450 nm值。

1.4.2 最佳ELISA工作条件的确定采用方阵滴定法确定包被抗原的最佳包被浓度，以及阴性、阳性猪血清的最佳稀释比例，从而确定待检血清的最佳稀释比例。通过优化包被缓冲液、最佳封闭液以及最佳二抗工作浓度，最终确定ELISA的最优工作条件。

1.4.3 临界值的确定取91份猪HEV阴性血清，在已确定的优化条件下进行ELISA检测，经统计学分析，得到所有阴性血清的OD450 nm的平均值和标准差。根据统计学原则，ELISA的阴、阳性判定值(Cut-off)=所有阳性血清OD450 nm平均值+3×标准差。待检血清OD450 nm值≥ Cut-off值判定为阳性，OD450 nm< Cut-off值判定为阴性。

1.5 特异性试验

分别将猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒和猪细小病毒的阳性血清按照已建立的ELISA方法进行检测，同时设立猪HEV阴性和阳性血清对照，分析其他重要猪疫病阳性血清是否与包被的抗原发生反应。

1.6 敏感性试验

将猪HEV阳性血清按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400和1∶12 800稀释后，用该ELISA检测，根据Cut-off值分析该ELISA的敏感性。

1.7 重复性试验

板内重复性试验：利用纯化的蛋白包被ELISA板，分别随机选取4份猪HEV阳性和阴性血清，每份样品设立3个重复孔，按优化条件进行ELISA操作，计算同一份样品OD450 nm值的变异系数(CV%)，以检验板内检测样品的重复性。

板间重复性试验：取三块酶标板，以同一批制备的蛋白包被，同样利用上述选取的4份猪HEV阳性和阴性血清，按优化条件进行ELISA检测，计算板间相同样品OD450 nm值的变异系数(CV%)，以检验板间检测样品的重复性。

1.8 对比试验

利用建立的ELISA方法与万泰HEV抗体检测试剂盒、南京森贝咖和上海酶联猪HEV抗体检测试剂盒同时对临床收集的182份猪血清进行检测，对比试验结果，分析本研究建立的ELISA方法与上述三种商品化试剂盒的符合率。

1.9 临床应用

运用建立的ELISA方法，对实验室保存的猪HEV感染不同周(0～8周)的45份血清和陕西杨凌区周边不同集约化养猪场的477份猪血清进行检测。

2 结果

2.1 SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达和纯化

将重组表达质粒pET-21b-sHEV-ORF2-C和空载体pET-21b转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达后，SDS-PAGE分析sHEV-ORF2-C蛋白获得表达，大小约为40 ku(图1A)。超声波裂解菌液，蛋白主要以包涵体的形式存在。通过蛋白复性以及分子筛纯化后，获得比较纯的目的蛋白。利用猪HEV阳性猪血清分析表达蛋白的抗原性，Western blot结果证明表达的蛋白反应原性较好(图1B)。

M.预染蛋白质相对分子质量标准；1. pET-21b(+)空载体诱导表达；2. 重组质粒pET-21b-sHEV-ORF2-C诱导表达；3. 分子筛纯化的目的蛋白；4. 未纯化目的蛋白与阳性猪血清免疫印迹；5. 纯化目的蛋白与阳性猪血清免疫印迹M. Prestained protein marker; 1.pET-21b(+) blank vector; 2. Recombinant plasmid pET-21b-sHEV-ORF2-C; 3. Purified protein; 4. Unpurified protein reacting with the positive pig sera; 5. Purified protein reacting with the positive pig sera图1 SDS-PAGE(A)和Western blot(B)鉴定目的蛋白的表达Fig.1 Identification of the target protein by SDS-PAGE (A) and Western blot (B)

2.2 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

棋盘滴定法检测结果显示，当酶标板每孔包被抗原200 ng，血清稀释度为1∶200时，阳性血清OD450 nm值为2.865，阴性血清相应值为0.059，阳性和阴性血清OD450 nm值相差最大(P/N=48.56)。因此，200 ng为最佳的抗原包被量，1∶200为最佳血清稀释度(表1)。

2.3 最佳包被缓冲液和封闭液的确定

将纯化的抗原分别用0.01 mol·L-1的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)和0.01 mol·L-1的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)包被酶标板，4 ℃过夜。然后再分别用2.5% 脱脂奶粉和5%脱脂奶粉作为封闭液，室温孵育1 h，其他步骤按照优化的ELISA条件检测阳性和阴性血清。结果显示当用0.01 mol·L-1的碳酸盐缓冲液包被，2.5%脱脂奶粉封闭时，阳性血清的OD450 nm值可达2.145，阴性血清相应值为0.054，且此时阳性和阴性血清的OD450 nm值相差最大(P/N=39.85)，因此选择0.01 mol·L-1碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，2.5%的脱脂奶粉为封闭液(表2)。

表1间接ELISA最佳抗原包被量和血清最佳稀释倍数的确定(OD450 nm)

Table1Determinationofoptimalamountofcoatingantigenanddilutionofsera(OD450 nm)

血清稀释倍数Serum dilution包被抗原量/(ng·孔-1)Antigen amount501002004001∶50+1.4681.5681.6321.712-0.0980.0980.0950.098P/N15.0616.0017.1817.381∶100+1.5031.7151.9221.889-0.0790.0670.0670.068P/N19.0325.6028.6927.931∶200+1.8302.0752.8652.124-0.0580.0540.0590.052P/N31.5538.4348.5640.801∶400+1.5411.6981.8131.676-0.0460.0430.0420.043P/N33.1439.4942.6638.98

P/N值系用未修约实测值计算，下表同

P/Nvalue were calculated using the data before rounding off. The same as below

表2最佳包被缓冲液和封闭液的确定(OD450 nm)

Table2Determinationofoptimalcoatingandblockingbuffers(OD450 nm)

包被液Coating buffer封闭液Blocking buffer2.5%脱脂奶粉2.5% dry milk5%脱脂奶粉5% dry milk碳酸盐缓冲液+2.1451.867Carbonate buffer-0.0540.057P/N39.8532.75磷酸盐缓冲液+1.5431.378PBS buffer-0.0670.067P/N23.0020.56

2.4 酶标二抗最佳工作浓度的确定

将商品化HRP标记的羊抗猪二抗，按照说明书分别选取1∶5 000和1∶10 000稀释，利用ELISA检测阳性和阴性猪血清，结果(表3)显示当二抗稀释比例为1∶5 000时，阳性和阴性血清OD450 nm值相差最大(P/N=55.87)。因此，HRP标记的羊抗猪二抗最佳稀释比例为1∶5 000。

表3酶标二抗最佳稀释比例的确定(OD450 nm)

Table3Determinationofoptimaldilutionofsecondantibody(OD450 nm)

二抗稀释倍数Second antibodies dilution阳性Positive阴性NegativeP/N1∶5 0002.9050.05255.871∶10 0002.1190.04745.09

2.5 临界值的确定

对91份猪HEV阴性猪血清进行ELISA检测，OD450 nm值的平均值为0.104，标准差为0.064。根据公式算得Cut-off值为0.296，即待检血清OD450 nm值≥0.296时判定为阳性，OD450 nm值<0.296时则判定为阴性。

2.6 特异性试验

用建立的ELISA方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒和猪细小病毒的阳性血清以及猪HEV的阴性和阳性血清进行检测，其OD450 nm值分别为0.063、0.076、 0.059、0.092、0.067、0.051和2.204。其他病毒的阳性血清和猪HEV阴性血清的OD450 nm值均< 0.296，表明建立的ELISA特异性好。

2.7 敏感性试验

将猪HEV阳性血清分别进行1∶100～1∶12 800 倍比稀释，然后用建立的ELISA进行检测，结果显示，当阳性血清1∶6 400稀释时，其OD450 nm值仍大于0.296，而1∶12 800稀释时，OD450 nm值小于0.296(表4)。

表4间接ELISA敏感性试验结果(OD450 nm)

Table4SensitivityofthedevelopedindirectELISA(OD450 nm)

血清稀释倍数Serum dilution阳性血清Positive serum阴性血清Negative serum1∶1002.0810.208 71∶2002.2010.163 41∶4002.0120.121 21∶8001.8360.094 31∶1 6001.2450.079 81∶3 2000.6840.045 61∶6 4000.3470.042 31∶12 8000.0920.032 1

2.8 重复性试验

板内重复试验是将8份不同猪血清(4份阳性和4份阴性血清)，在同一块酶标板上各重复检测3次，计算标准差。结果板内重复试验变异系数最大为7.05%，最小为0.09%，表明同一样品在同一板内检测变异系数很小，重复性好(表5)。

板间重复试验是将8份不同的猪血清同时在3块酶标板上检测，每块板重复检测3次，计算标准差。结果显示每份血清在不同板之间OD450 nm值相差甚微，板间变异系数最大为7.68%，最小为1.22%，表明同一份样品在不同酶标板之间变异系数也很小，重复性好(表5)。

2.9 与商品化试剂盒符合率试验

用本研究建立的ELISA方法和北京万泰、南京森贝咖和上海酶联三种商品化猪HEV抗体检测试剂盒同时检测182份临床猪血清，结果表明建立的ELISA检测阳性93份，阴性89份；北京万泰商品化试剂盒检测阳性77份，阴性105份；上海酶联商品化试剂盒检测阳性47份，阴性135份；南京森贝咖商品化试剂盒检测阳性仅11份，阴性171份。该ELISA方法与三种商品化试剂盒的符合率分别为91.2%、53.3%和51.6%(表6)。

表5间接ELISA板内和板间重复试验结果

Table5ReproducibilityanalysisofthedevelopedindirectELISA

猪血清编号Serum No.板内变异试验Inter-assay variability板间变异试验Intra-assay variability平均值x-标准差s变异系数/%CV平均值x-标准差s变异系数/%CV12.3280.0381.622.3370.0964.1222.1710.0793.562.1600.0743.4232.1120.0914.292.0850.0572.7342.3130.0552.402.2710.0662.9050.0570.0047.050.0590.0032.7860.0710.0023.240.0730.0011.9070.0640.0010.090.0650.0057.6880.0690.0072.340.0690.0011.22

表6间接ELISA与三种商品化试剂盒对比试验结果

Table6ComparisonsofthedevelopedindirectELISAwiththethreecommercialkitsfordetectinganti-swineHEVantibodiesinpigsera

检测方法Detection methods阳性Positive阳性符合率/%Positive coincidence阴性Negative阴性符合率/%Negative coincidence总符合率/%Total coincidenceELISA9389北京万泰试剂盒7782.810510091.2上海酶联试剂盒4729.013578.753.3南京森贝咖试剂盒118.617196.651.6

2.10 临床样品检测

应用建立的ELISA检测猪HEV感染5头HEV阴性猪后不同周的血清，结果显示，感染后第2周，所有猪开始HEV抗体转阳，其中2头感染后第7周抗体转阴，而其余3头猪感染后第8周，ELISA检测结果仍呈阳性(图2)。应用建立的ELISA检测杨凌周边10个集约化猪场共477份血清，检测结果显示8个猪场为猪HEV抗体阳性，477份血清中210份为阳性，阳性率为44.03%。不同猪场的检测结果见表7。

3 讨论

戊型肝炎是人畜共患疾病，近几年发病率逐年升高，严重危害人类健康。猪、野鹿和兔是HEV的自然储存宿主[1]。1997年Meng等[5]首次从猪体内分离获得猪HEV，并发现猪HEV可以感染人。因此，密切监控猪群中HEV感染具有重要的公共卫生意义。目前，对猪HEV的检测技术主要包括免疫电镜、巢式RT-PCR和ELISA[12]。其中，ELISA检测快速且方便，被广泛应用[10]，但是目前猪HEV抗体检测的ELISA方法，一类是利用人HEV抗体检测的商品化试剂盒通过二抗(由抗人变为抗猪)的改变进行检测，ELISA条件需要重新优化，导致结果难以判定；还有一类商品化试剂盒分别采用猪HEV ORF2和ORF3蛋白的不同抗原肽为包被抗原，由于不同抗原肽引发猪免疫应答反应的差异性，导致该类试剂盒检测结果的符合率差。因此，急需建立一种准确性、敏感性和特异性较高的ELISA方法。本研究利用原核表达的猪HEV ORF2蛋白C端268个氨基酸区域为包被抗原，通过优化ELISA条件，并分析方法的敏感性和特异性，成功建立了猪HEV抗体检测的间接ELISA方法。同时，利用该方法检测猪HEV感染后不同时间以及临床收集的猪血清，结果表明该ELISA方法可以用于猪群中HEV感染的监测。

图2 间接ELISA检测猪HEV攻毒后猪血清中抗体变化规律Fig.2 Detection of anti-swine HEV IgG antibodies in sera from the challenged pigs by the indirect ELISA

表7间接ELISA检测临床猪血清中猪HEV抗体结果

Table7Detectionofanti-swineHEVIgGantibodiesintheclinicalpigserafromdifferentflocksbytheindirectELISA

猪场Pig farm样品总数Total number阳性样品数Positive number阳性率/%Positive rate毕公482450.00本原483777.08实训483266.67金凤483062.50李家481531.25延川4800凤翔484593.75黄陵45511.11五泉4800姚安482245.83

不同哺乳动物HEV分离株主要分为8个基因型[13]，基因3和4型可感染猪，我国猪群中主要流行基因4型[6-7]。不同HEV基因型仅有一个血清型，因此，不同基因型的ORF2蛋白均可以用于检测猪血清中的HEV抗体，但也有研究表明不同基因型的ORF2蛋白检测的结果会有部分差异[11]。我们建立的ELISA方法与北京万泰商品化试剂盒符合率为91.2%，而北京万泰试剂盒是采用基因1型HEV ORF2蛋白为包被抗原，因此，部分不符合的样品可能是由于不同基因型抗原差异所导致，进一步证实了上述推论。因此，本研究利用我国猪群中流行的基因4型猪HEV ORF2蛋白为包被抗原，进一步提高了猪HEV抗体检测的特异性和敏感性。

猪HEV全长ORF2蛋白包含多个抗原区，不同抗原区刺激机体免疫应答反应差异显著，从而导致利用不同截短的ORF2蛋白为抗原建立的ELISA，相互之间检测结果符合率低[14-16]。本研究建立的ELISA与北京万泰商品化试剂盒符合率较高,为91.2%，而与上海酶联和南京森贝咖的商品化试剂盒符合率仅为53.3%和51.6%，查阅试剂盒说明书，发现北京万泰商品化试剂盒采用的包被抗原为原核表达的病毒样颗粒，与本研究所用的抗原相似，故符合率较高，其部分差异可能是由于不同基因型所致；而上海酶联试剂盒所用抗原为缺失aa 368-392抗原区的截短ORF2蛋白，南京森贝咖的则同时还缺失了aa 606-660抗原区。前期研究发现，上述两个抗原区是HEV主要的显性抗原区，刺激机体产生抗体时间早、持续期长[17]。因此，该两种试剂盒检测猪血清中HEV抗体可能存在大量假阴性。本研究建立的ELISA方法所用的抗原包含了上述两个主要显性抗原区，从而大大提高了检测的精确性。

ELISA方法检测抗体所用的包被抗原，一方面可以采用天然病毒颗粒或病毒亚单位蛋白，另一方面可以采用基因工程技术体外表达的病毒亚单位蛋白。为便于纯化，通常将标签蛋白与目的蛋白进行融合表达，但是由于标签蛋白的抗原性，易造成假阳性。前期，我们将猪HEV ORF2蛋白C端268个氨基酸与His标签进行融合表达，结果发现表达蛋白发生多聚化，His标签包装至多聚体内部，导致纯化蛋白纯度不高。随后利用该融合蛋白建立的猪HEV抗体间接ELISA检测方法，检测结果假阳性比例高。本研究基于上述问题，重新设计引物构建表达载体，仅表达猪HEV ORF2蛋白268个氨基酸区域，不带任何标签，然后通过蛋白复性和分子筛纯化后，获得了纯度非常高的抗原，成功解决了上述问题。已有的血清学调查发现，猪HEV感染在我国不同地区的猪群中非常普遍，阳性率在30%～100%[18-21]。本研究利用建立的间接ELISA调查陕西杨凌周边养猪场猪HEV感染情况发现，各猪场阳性率为0%～93.75%。由于猪HEV的人畜共感染性，所以，需定期监控上述猪场中猪HEV感染情况，及时制定预防措施，减少对人传播的可能。