RIP1/RIP3通路介导氯化血红素诱导的HT-22海马神经细胞损伤的研究
2018-10-29苏兴奋王汉东林元相陈伏祥
苏兴奋 王汉东 林元相 陈伏祥
脑出血引起的继发性脑损伤的损伤机制是多样的,如红细胞及降解产物毒性、谷氨酸兴奋性毒性、氧化损伤、炎症及细胞死亡通路激活等[1]。脑出血后数周内血红蛋白在脑实质内被氧化、降解,降解产生的毒性产物如氯化血红素(hemin)和铁离子可持续加重脑损伤。血液中大概有2.5 mmol/L的血红蛋白,在脑组织中降解后可产生约10 mmol/L的hemin[2]。Hemin是亲脂性氧化剂,以很高的浓度积聚在血肿内损伤神经细胞。已有研究证实,3~30 μmol/L的hemin在4~14 h内可以有效杀死60%~70%的神经元和星形胶质细胞[3,4]。脑出血后在血肿内及血肿周围出现大量的凋亡细胞和坏死细胞。细胞凋亡是机体在发育或病理过程中细胞主动的,由基因控制的细胞程序性死亡方式。细胞凋亡的主要特征有细胞皱缩、染色质凝集、细胞出芽、DNA片段化及凋亡小体的产生。在凋亡的过程中,细胞膜保持完整,不会引起炎症反应。已有大量的报道研究细胞凋亡在脑出血中的作用,而对于细胞坏死却鲜有研究[1,12]。其原因可能是既往认为细胞坏死是一种意外的、不可逆的非程序性细胞死亡。然而,随着对细胞死亡机制的不断深入研究表明细胞坏死并不全是被动的、不受调控的,近期一些研究揭示一些细胞坏死可以是主动的,受到特定基因及信号分子的调控,这类细胞坏死称为“necroptosis”或“程序性坏死”[5]。 程序性坏死细胞具有坏死样的形态特征,细胞膜破坏,细胞及细胞器肿胀,线粒体膜电位缺失,引起局部炎症反应等特征。进一步研究发现这个过程受RIP1和RIP3调控,并可被RIP1特异抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)抑制[5]。已有研究证实程序性坏死在谷氨酸、NMDA诱导的神经损伤中发挥作用[6,7]。但程序性坏死在hemin诱导的细胞损伤中的作用尚不明确。本研究利用药物研究Nec-1在hemin诱导的HT-22细胞死亡中潜在的神经保护作用和基因干预手段,明确RIP3在hemin诱导的HT-22细胞死亡中的作用。
材料与方法
一、细胞株与主要试剂
小鼠海马神经元细胞株HT-22购自ATCC(美国)。zVAD 购自 BD bioscience(美国)。Necrostatin-1、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、 hemin、叔丁基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、Hoechst、碘化丙啶(propidium iodide,PI)购自 Sigma(美国)。青霉素/链霉素双抗、MitoSox Red、DMEM、Optimem I培养液和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Invitrogen(美国)。Cell titer glo试剂盒购自Promega(美国)。NegativesiRNA使用siCONTROLnon-targeting siRNA,RIP3 siRNA 使 用 RIP3 ON-TARGET plus SMART pool siRNA,均购自Dharmacon(美国)。 细胞转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen(美国)。 小鼠 RIP3抗体 (Proscience, 美国),β-actin(Sigma-Aldrich,美国)用于Western蛋白印迹实验。
二、细胞培养及分组
将HT-22细胞接种培养于含10%FBS(Invitrogen,美国)的DMEM培养基中,并置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。在实验前使用0.25%胰酶消化分离HT-22细胞,培养基更换为2%FBS的DMEM,计数后细胞以3000个/孔接种于96孔板中。过夜后进行实验分组(每组3个孔)及药物处理。首先,将HT-22细胞分为4组(每组3个孔),分别加入 0、25、50、100 μmol/L 的 hemin 处理 24 h,然后使用PI/Hoechst染色,统计各组细胞中PI阳性细胞的比例及细胞存活率。而后分别用DMSO、zVAD(20μmol/L)、Nec-1(30 μmol/L)、hemin(50 μmol/L)、hemin+zVAD、hemin+zVAD+Nec-1、hemin+Nec-1 和 hemin+BHA(100 μmol/L)处理 HT-22 细胞 24 h 后加 PI/Hoechst染色并统计PI+细胞比例,同时测定细胞存活率。
三、细胞存活率检测
Cell titer glo试剂盒是通过检测细胞三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平来定量细胞存活率。根据试验试剂盒的使用说明书,在96孔板中培养的各实验组细胞进行相应处理24 h后,每个需要检测的孔内加入30 μL的cell titer glo试剂,在培养箱内孵育10 min,然后静置10 min并在Wallac VictorⅡ读板器上检测化学发光值。
四、PI及Hoechst细胞染色
实验组中加入PI和Hoechst,其终浓度为2 μg/mL,在培养箱内避光孵育10 min,然后在荧光显微镜下每个孔分别随机拍摄3张200倍视野的PI和Hoechst照片,使用Image J软件进行细胞计数。 PI+(%)=PI+/Hoechst+。
五、MitoSox Red及Hoechst染色
MitoSox Red是活性氧(reactive oxy gen species,ROS)敏感的指示剂,使用MitoSox Red检测线粒体ROS水平。在DMSO、hemin和hemin+Nec-1组细胞中分别加入MitoSox Red及Hoechst,然后在培养箱内避光孵育10 min,然后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤3次,在荧光显微镜下观察并拍照。
六、siRNA转染
细胞按每孔2×105个接种于6孔板过夜。将Negative和RIP3 siRNA和Lipofectamine 2000分别稀释到等体积OptimemⅠ培养基中并在室温放置平衡10 min,然后将两者混合并轻轻混匀,在室温放置20 min,然后将混合液加入到六孔板细胞培养基中,siRNA终浓度为 60 nmol/L,Lipofectamine为2 μL/mL。细胞置于培养箱中转染4 h后,加入新鲜的常规培养基。细胞转染48 h后将细胞消化下来,以3000个/孔接种于96孔板过夜后进行药物处理,分为不加 hemin刺激的对照 Control组及 50 μmol/L hemin刺激组,其余细胞培养至72 h后收集进行Western blot分析。
七、细胞裂解和Western blot分析
将细胞从6孔板刮下,离心机1500 r/min、4℃离心5 min,用冷PBS洗涤1次,再次离心后加入500 μL预冷的细胞裂解缓冲液,冰上用超声细胞破碎仪超声破碎5 s,然后置于离心机13 000 r/min、4℃离心15 min,取上清为细胞裂解液,并进行蛋白定量,然后进行Western蛋白印迹分析。取50 μg蛋白加入相应的5×上样缓冲液,混匀后于100℃水浴变性5 min,离心后取蛋白于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,然后将凝胶上的蛋白质电转至醋酸纤维素膜。将膜置于TBST配置的含5%脱脂奶粉封闭液中,室温摇晃封闭2 h,洗涤后加入按相应比例稀释的一抗(RIP3 1∶1000,β-actin 1∶2000),4℃包被过夜。用TBST洗涤3次,每次10 min。然后加入辣根过氧化物酶标记的与一抗对应的二抗摇晃孵育1 h,用TBST洗3次,每次10 min。随后加入增强化学发光溶液,于暗室中用X光胶片自显影。胶片经显影、定影、晾干、扫描,获得目标蛋白条带,分析实验结果。用Image J软件进一步分析条带密度。
八、统计学分析
采用SPSS19.0软件进行统计学分析,使用方差分析及Tukey进行多重比较。所有实验至少重复3次,数据表达为均数±标准差(±s),使用 GraphPad Prism5软件进行作图。P<0.05为差异具有统计学意义。
结 果
一、Hemin诱导HT-22细胞死亡
图1A和B所示,随着hemin浓度的增加,PI+细胞比例也梯度增加,当hemin浓度为50 μmol/L时其PI阳性细胞比例为52.4%±6.0%。进一步使用Cell titer glo测定各组细胞ATP含量即细胞存活率。图1C所示,随着hemin浓度增加,HT-22细胞存活率梯度下降,50 μmol/L hemin处理使得HT-22的存活率下降到47.2%±2.8%。
二、Caspase非依赖性程序性坏死介导hemin诱导的HT-22细胞死亡
图2所示,与DMSO组相比,hemin处理后PI+(46.0%±5.0%)显著升高,细胞存活率(44.6%±12.7%)也显著减低;与hemin组相比,Nec-1处理后明显减少 PI+细胞(18.5%±14.0%),细胞存活率(76.7%±14.3%)显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。另外,与hemin组比较,hemin+zVAD并不能减低 PI+细胞(46.6%±2.3%)或提高细胞存活率(41.1%±9.9%);而与 hemin+Nec-1组相比,hemin+zVAD+Nec-1也没有进一步减少 PI+(16.7%±5.7%)或增加细胞存活(71.1%±14.8%),差异均无统计学意义(P>0.05)。
三、ROS积聚介导hemin诱导的HT-22细胞死亡
图3所示,HT-22细胞经hemin刺激后细胞内的ROS水平明显升高,而Nec-1处理明显减少了细胞内ROS水平。进一步使用BHA处理细胞,结果显示BHA能显著减轻hemin诱导的细胞坏死(图4)。
四、敲低RIP3对hemin诱导的HT-22细胞死亡的影响
使用siRNA敲低细胞中RIP3蛋白的表达,使用Western blot技术在转染72 h后检测细胞内RIP3蛋白水平,结果显示RIP3蛋白明显下调(图5A)。各组分别给予相应刺激24 h,行PI和Hoechst染色,如图5B所示,RIP3敲低组PI+细胞明显减少。进一步统计各组细胞PI+率及细胞存活率,结果显示与Negative siRNA+hemin组比较,RIP3被敲低以后PI+细胞数也明显减少(图5C),细胞存活率明显升高(图 5D),差异均有统计学意义(P<0.05)。
讨 论
脑出血后血液成分被释放到脑实质中,红细胞降解为血红蛋白,随后血红蛋白降解为hemin[12]。Hemin是亲脂性氧化剂,以高达毫摩尔浓度水平积聚在血肿内,能够损伤多种神经细胞,例如神经元和星型胶质细胞[4,12]。本研究首次显示hemin以浓度依赖的方式诱导HT-22的细胞死亡,并且大多数死亡细胞为PI+的坏死细胞。笔者选择浓度为50 μmol/L的hemin进行后续实验。
图1 氯化血红素剂量依赖性的诱导HT-22细胞死亡
图2 Nec-1和zVAD对氯化血红素诱导的HT-22细胞死亡的影响
图3 Nec-1对氯化血红素诱导HT-22细胞产生的活性氧的影响
图4 活性氧清除剂叔丁基羟基茴香醚对氯化血红素诱导HT-22细胞死亡的影响
程序性坏死在多种疾病中发挥作用,包括脑缺血、脑外伤、脑出血等[14-16]。程序性坏死是受调控的细胞坏死,具有坏死细胞的形态特征,其受特定的通路调控,包括RIP1和RIP3[5,13]。RIP1是程序性坏死的促发蛋白。Nec-1是RIP1的特异性抑制剂,特异性的抑制RIP1的活性[17]。既往的研究显示Nec-1可抑制谷氨酸诱导的HT-22细胞死亡[6]。同时有研究证明Nec-1可抑制hemin诱导的星形胶质细胞死亡[4]。新近文献报道在hemin诱导的神经元死亡中RIP1 mRNA和蛋白表达增加,Nec-1处理可抑制RIP1的表达和减轻细胞死亡,另外在小鼠脑出血模型中在抑制RIP1的活性可减轻细胞死亡和改善功能预后[19,20]。因此,笔者推测RIP1可能在hemin诱导的HT-22细胞死亡中起作用。本文首先研究Nec-1是否能抑制hemin诱导的HT-22细胞死亡,结果显示hemin诱导的HT-22细胞死亡可被Nec-1抑制,却不能被凋亡抑制剂z-VAD所抑制,表明hemin诱导的HT-22细胞死亡可能主要是通过RIP1激酶的作用。
研究证明ROS在程序性坏死的执行中起关键作用[8,13]。在本文的hemin诱导HT-22神经细胞损伤模型中,当给予hemin处理后HT-22细胞中的ROS水平显著增高,并可以被Nec-1抑制。而hemin引起的HT-22细胞死亡可进一步被ROS清除剂BHA所抑制。Nec-1并非ROS清除剂,却可以抑制ROS。这些结果证明ROS积聚是hemin诱导的HT-22细胞死亡的一个重要因素。RIP3的调控是TNF诱导细胞坏死的ROS的另一个重要来源[8]。RIP3和多种参与谷氨酰胺代谢和糖原分解相关的代谢酶相互作用,最终过度激活线粒体呼吸链,能量耗竭,并产生大量细胞毒性的ROS[8]。在程序性坏死中ROS的释放极为剧烈,是细胞凋亡的几倍甚至数十倍。大量产生的ROS导致脂质过氧化、溶酶体膜通透化等,并直接损伤破坏线粒体膜、溶酶体膜及细胞膜,细胞器和细胞水肿、崩解,呈现细胞坏死的形态学特征,导致细胞坏死[5]。但HT-22细胞是如何通过ROS来执行hemin诱导的程序性坏死还需要进一步研究。
图5 敲低受体相互作用蛋白激酶3水平抑制氯化血红素诱导HT-22细胞死亡
RIP3是调控细胞坏死的另一特异性蛋白分子[9-11]。在坏死信号刺激下,RIP3被募集到RIP1上形成稳定的RIP1-RIP3复合物,激活RIP3下游信号通路,进而启动程序性坏死[9-13]。因此,本研究进一步通过基因干预手段研究RIP3是否在hemin诱导的HT-22细胞死亡中也发挥作用。结果显示在hemin诱导的HT-22死亡模型中通过siNRA敲低RIP3后坏死细胞明显减少,细胞存活率明显升高。已有研究报道小鼠脑出血后RIP1、RIP3蛋白表达显著升高,相互作用形成RIP1-RIP3复合体,RIP1激酶特异性抑制剂Nec-1抑制RIP1与RIP3的相互作用,进而减轻脑血肿周围细胞坏死,减轻脑水肿,改善神经功能预后[16]。RIP3基因敲除可显著地减少血肿内和血肿周围的坏死细胞数量[18]。这些研究表明程序性坏死及其通路RIP1/RIP3在脑出血后的继发脑损伤中起到重要的作用。
综上所述,RIP1和RIP3可能是hemin诱导HT-22细胞死亡的重要干预靶点,Nec-1可能是有效的治疗手段,但其具体机制及疗效有待于进一步研究。