纤维素降解菌的筛选及酶活力条件优化研究

韩耀洋

（成都七中嘉祥外国语学校，四川 成都 610000）

世界上平均每年大约生成1 000亿t植物纤维素物质，如秸秆、废弃纤维产品等，其中仅有一小部分能够被回收利用，其他绝大多数都采用焚烧或者填埋等手段进行处理，不仅造成资源的浪费，还会对环境产生巨大的破坏[1～3]。因此，如何有效地处理这些纤维素废弃物已经成为热门课题之一。木质纤维素降解菌是一类具有高效降解纤维素或堆肥发酵能力的微生物，具有无污染、成本小、速度快等优点，因此筛选出活性高、稳定性强、适用环境广的纤维素降解菌是当前研究的重难点之一[4～7]。通过对腐殖土壤中分离筛选的高效纤维素降解菌在不同环境下的活性情况进行研究，旨在通过其在不同温度、不同pH值条件下的活性，合理优化、构建高效的纤维素降解菌，为处理纤维素废弃物提供参考[8，9]。

1 试验材料与方法

1.1 菌株材料来源

试验用纤维素降解菌来自实验室前期筛选的菌株S2，经鉴定为木霉菌（Trichoderma sp.）。

1.2 培养基

纤维素刚果红培养基：称取羧甲基纤维素钠 2 g、（NH4）2SO42 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、刚果红0.4 g、琼脂12 g，加蒸馏水950 mL加热溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl将pH值调至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min后待用。

LB液体培养基：称取酵母浸粉5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，加蒸馏水950 mL加热溶解后，再用1 mol/L NaOH或HCl将pH值调至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min后待用。

羧甲基纤维素钠培养基：称取羧甲基纤维素钠10 g、 蛋 白 胨 2 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、酵母膏0.5 g和琼脂粉10 g，加蒸馏水950 mL加热溶解后，用1 mol/L NaOH或HCl将pH值调至 7.0，定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min后待用。

1.3 发酵培养

将纯化后的纤维素降解菌S2接种到培养基中（每250 mL锥形瓶中装有100 mL液体培养基），于35℃恒温摇床中175 rpm/min培养48 h。

1.4 试剂配制

3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取 6.3 g DNS加入262 mL 2 mol/L NaOH溶液（作为A液）中，另称取182 g酒石酸钾钠加入500 mL蒸馏水中，加热溶解（作为B液）。将A液加入B液后，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，完全溶解后定容到1 000 mL，贮存于棕色瓶中保存。

1%葡萄糖标准溶液：准确称取烘干后的葡萄糖1 g，加蒸馏水定容到100 mL。

1.5 酶活力的检测

取发酵培养48 h后的发酵液，4 000 rpm/min离心10 min后取上清液作为粗制酶液，经过试验适量稀释。取0.5 mL酶液加入试管中，加入1 mL 1%羧甲基纤维素钠与0.5 mL PBS，于37℃水浴30 min后，加入1 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却后加入5 mL蒸馏水，混匀后用分光光度计在540 nm处检测吸光值[10]。

葡萄糖标准曲线的绘制：按表1依次加入各种试剂后，加入0.5 mL灭活后的酶液，其余步骤同上。

表1 葡萄糖标准曲线的绘制

酶活力：即为每毫升酶液在此反应条件下1 min内使底物降解生成1μmol葡萄糖所需的酶量。

1.6 最适条件的优化

最适pH的培养：将S2分别接种到初始pH值为4、5、6、7、8、9、10 的液体培养基中，于 35 ℃恒温摇床中175 rpm/min培养48 h，检测酶活力。

最适培养温度的检测：在最适pH值的情况下，将S2分别在不同温度下（29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃）恒温摇床中175 rpm/min培养48 h，检测酶活力。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线的绘制如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

由图1可知不同葡萄糖浓度所对应的吸光值（mg/mL），公式为 y=0.024x+0.006 66(R2=0.993 05)，后续试验可根据这个标准曲线计算出不同pH值和温度下的葡萄糖浓度，从而计算出酶活力。

2.2 不同初始pH值对S2酶活力的影响

不同初始pH值对S2酶活力的影响如图2所示。

图2 不同初始pH值对S2酶活力的影响

由图2可以看出，纤维素降解菌S2在酸性条件下（pH值=4或5）吸光值均小于0.3，酶活力较低；S2吸光值在pH值=6时吸光值达到最大值0.64，说明此时酶活力最高；而随着初始pH值的增加，吸光值逐步降低，在pH值=10时吸光值达到最小值0.12。

2.3 不同培养温度对S2酶活力的影响

不同培养温度对S2酶活力的影响如图3所示。

由图3可以看出，纤维素降解菌S2在较高和较低温度下吸光值较低，表示酶活力较低；在33℃时吸光值达到最大值0.41，说明此时酶活力最高；随着培养温度的增加，吸光值逐步又降低到0.29。说明33℃是S2最佳培养温度。

图3 不同培养温度对S2酶活力的影响

综上所述，纤维素降解菌在降解功能的筛选中根据目的和阶段的不同，应采用不同的培养基；而不同种属的微生物特性不同，表现出的酶活力在不同初始pH值和培养温度下完全不一样。研究表明，细菌和真菌对纤维素的降解机理存在不同，细菌主要通过细胞表面酶进行降解，所以需要附着在纤维素表面进行；而真菌是直接分泌多种细胞外酶进行降解[11]。在本研究中，木霉菌S2对纤维素具有较好的降解效果，同时通过对其培养条件的优化，旨在提高其降解效果[12]。通过试验证明，S2的最佳初始pH值为6，最佳培养温度为33℃。