巴西龟眼炎病原菌的分离鉴定及组织病理学研究

叶明皓，胡秀彩，吕爱军，孙敬锋，刘小雪，宋亚娇

(1.天津农学院 水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007)

雷氏普罗威登斯菌属于肠杆菌科Enterobacteriaceae、普罗威登斯菌属Providencia[1]。研究表明，人类感染雷氏普罗威登斯菌可引发腹泻、肺炎、尿道炎等多种疾病[2-3]。近年来，雷氏普罗威登斯菌可导致鱼、虾、鳖等多种水产动物发病死亡[4-6]。Faisal等[4]从濒死尼罗罗非鱼Oreochromisniloticus体内分离得到雷氏普罗威登斯菌。Bejarano等[5]从濒死鲢Hypophthalmichthysmolitrix心脏、肾脏等组织分离获得雷氏普罗威登斯菌。战文斌等[6]从患败血病对虾Fenneropenaeuschinensis体内分离出雷氏普罗威登斯菌。范红结等[7]从患病中华鳖Trionyxsinensis肝、脾和肺等实质器官均分离鉴定到雷氏普罗威登斯菌。李林俐等[8]对发病与死亡扬子鳄Alligatorsinensis进行病原学分离研究，鉴定病原菌为雷氏普罗威登斯菌。但是，关于雷氏普罗威登斯菌感染龟鳖类动物导致眼炎病例，目前尚未见文献报道。

近年来，由于养殖水环境污染加剧，龟类细菌性疾病频繁发生，往往造成巨大的经济损失[9-13]。杨瑞婷[13]报道，巴西龟眼炎主要表现为眼睑发炎充血，后逐渐变成灰白色且肿大，眼角膜和鼻黏膜糜烂，严重时双目失明，呼吸受阻等。最近，天津市某宠物龟养殖场的巴西龟发病，主要表现为眼睛发炎充血、肿大，精神沉郁、行动缓慢，摄食减少或停止摄食等临床症状，初步诊断为细菌性眼炎病例。本研究中，从发病龟眼内黏液中分离获得1株细菌，并对其进行细菌形态学观察、16S rDNA测序、生理生化特性、药敏试验、回归感染试验及病理学观察等系统研究，旨在为研究巴西龟眼炎的病原及其致病机理等提供数据资料，为该病的防治提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

健康巴西龟购自天津水产市场(体质量约8.0 g)，在实验室饲养观察2周，确认健康无病后用于后续试验。发病巴西龟(体质量约150.0 g)为天津市某宠物龟养殖场的送检病龟。

细菌生化鉴定管和药敏纸片均购自杭州滨和微生物试剂有限公司，PCR Master Mix试剂购自北京天根生化科技有限公司，pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司，胶回收DNA提取试剂盒(离心柱型)购自北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化 参照兰云等[9]的试验方法，将发病巴西龟体表病灶用无菌生理盐水冲洗，无菌操作取患病龟眼部组织及其分泌液划线接种于LB固体培养基上，28 ℃恒温下培养18 h。挑取优势单菌落接种纯化，经过3次纯化后得到纯菌种，置于冰箱(4 ℃)中保存备用。

1.2.2 细菌生理生化试验 将分离纯化后的菌株28 ℃下培养18 h，进行革兰氏染色镜检。将菌株无菌操作接种于细菌生化鉴定管中，进行硝酸盐还原、半固体动力、糖(醇、苷)类代谢等48种生理生化特性测定，具体方法参照文献[14-15]。

1.2.3 细菌基因组DNA提取及16S rDNA基因序列扩增 将分离菌株接种于LB液体培养基中，28 ℃、150 r/min摇床中培养过夜，取2 mL培养液于离心管中，4 ℃下以12 000 r/min离心2 min，弃去上清液；加500 μL超纯水，漩涡振荡30 s，置95 ℃下水浴5 min；再于4 ℃下以12 000 r/min离心2 min，取350 mL上清液为DNA模板，保存于-20 ℃中备用。

细菌的16S rDNA测序采用通用引物27F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′，1492R:5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′，引物来自生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR扩增反应体系(25 μL):2×TaqPCR Master Mix 10L，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，无菌双蒸水11 μL。PCR反应条件：95 ℃下预变性5 min；94 ℃下变性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共进行30个循环；最后在72 ℃下再延伸10 min。采用琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，并将PCR产物送天津金唯智生物科技有限公司进行基因测序。用胶回收试剂盒回收纯化16S rDNA目的条带，与pMD18-T载体连接反应转化至大肠杆菌DH5α中，采用引物M13-47:5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′，RV-M:5′ GAGCGGATAACAATTTC- ACACAGG 3′进行菌落PCR阳性克隆筛选，随机取阳性克隆送天津金唯智生物科技有限公司测序验证。

1.2.4 细菌16S rDNA基因序列及系统发育树分析 将16S rDNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，同时在NCBI下载已公布的普罗威登斯菌属细菌16S rDNA基因序列进行相似性比较，采用MEGA 5.2软件用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，并通过1000次的自举分析(bootstrap)进行置信度检测。

1.2.5 药敏试验 采用K-B纸片法对分离菌株进行29种常用抗生素药物的敏感性检测，将分离菌株均匀涂布于LB平板上，依次贴上药敏纸片，28 ℃下培养18 h后，测量抑菌圈直径，测量3次取其平均值，以抑菌圈直径大小作为判定细菌对药物敏感性的标准。

1.2.6 动物感染试验 随机选取20只健康巴西龟作为试验动物，感染组龟10只采取人工腹腔注射含菌量为1.88×108cfu/mL菌液，注射量为0.1 mL/只，对照组龟10只注射相同剂量的0.1 mL无菌生理盐水；饲养温度约为20 ℃，连续观察21 d，记录发病死亡情况。参照李玉平等[12]的方法对试验龟进行组织病理观察，无菌操作取正常和发病死亡巴西龟眼睑等组织放入波恩氏液中固定，用常规石蜡切片、H.E染色，观察并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 巴西龟眼炎病原菌的分离及理化特性

巴西龟发病主要表现为眼睛发炎充血、肿大，行动迟缓，摄食减少等临床症状，初步诊断为细菌性眼炎，从发病龟眼内分泌液中分离获得1株革兰氏阴性细菌，编号为G0503菌株。该菌在LB培养基28 ℃下培养18 h，菌落形态呈圆形、边缘整齐、透明湿润，直径为1.0～1.5 mm，该分离菌经染色镜检显示为革兰氏染色阴性短杆状细菌。细菌生理生化试验结果表明，该菌株与半乳糖、甘露醇、肌醇、甘露糖等反应为阳性，与赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶等反应为阴性，根据该菌株的形态学和理化特性，基本符合普罗威登斯菌属Providencia细菌的生理生化特征(表1)。

表1 菌株G0503的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the strain G0503

注：+ 表示阳性;-表示阴性;F表示发酵型

Note： +,positive; -,negative；F,fermentative type

2.2 分离菌的16S rDNA序列及系统发育树分析

以分离菌 株G0503基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增16S rDNA序列，通过琼脂糖凝胶电泳，检测出大小约为1500 bp的目的条带(图1泳道1、2)，PCR产物测序获得16S rDNA片段大小为1386 bp；进一步将其亚克隆至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中后筛选阳性克隆(图1泳道3、4、5)，测得16S rDNA长度为1500 bp (GenBank登录号：MG138153)。Blast比对结果表明，与模式菌株ProvidenciarettgeriDSM 4542(AM040492.1)的16S rDNA序列一致性均为99.30%，与Providenciarettgeri(JN644501.1)的16S rDNA序列一致性为99.60%。构建系统发育树分析显示,分离菌株G0503与Providenciarettgeri(JN644501.1)亲缘关系最近，自然聚为一支(图2)，最终判定G0503菌株为雷氏普罗威登斯菌。

注：M为DNA标准DL 2000；1、2为16S rDNA，3、4、5为阳性克隆Note: M,DNA standard DL 2000; 1 and 2, 16S rDNA, 3, 4 and 5, positive clones图1 菌株G0503的16S rDNA基因PCR扩增及阳性克隆检测Fig.1 PCR amplification and detection of 16S rDNA positive clone in the strain G0503

图2 基于16S rDNA基因序列构建的菌株G0503系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree of strain G0503 based on gene sequence of 16S rDNA

2.3 分离菌G0503的药敏特性

药敏试验结果显示：G0503菌株对头孢噻肟、头孢哌酮、诺氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星、美罗培南、亚胺培南等抗生素高度敏感；对头孢克肟、链霉素、庆大霉素、新霉素等抗生素中度敏感；对阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、卡那霉素、复方新诺明、磺胺异恶唑、甲氧嘧啶、萘啶酸、依诺沙星、恩诺沙星、四环素、阿奇霉素、万古霉素、克林霉素、利福平、呋喃唑酮、呋喃妥因等耐药。

用G0503菌株人工腹腔注射健康巴西龟感染6 d后，试验龟出现发病、死亡现象，21 d累积死亡率达40%(4/10)，感染龟主要临床症状为眼睛肿大、发炎充血、眼分泌液增多(图3)，精神沉郁，行动迟缓，摄食减少或停止摄食，偶有前肢抓挠眼部等现象。人工感染发病死亡巴西龟与自然发病症状基本相同，并且从病死龟体内分离到与G0503菌株特征一致的细菌。注射生理盐水的对照组龟，观察21 d无发病死亡现象。进一步进行组织病理学观察发现，病龟眼睑组织上皮细胞中的多边形细胞消失，出现淋巴细胞浸润、色素细胞增多等病变(图4-A)，而对照组正常巴西龟眼睑组织染色见图4-B。

3 讨论

3.1 雷氏普罗威登斯菌的致病性

普罗威登斯菌广泛分布于土壤、水体等自然环境中[16]。雷氏普罗威登斯菌不仅影响鱼、虾、龟鳖、鳄等水产动物健康养殖[6，8，17]，而且对人类饮食构成潜在危害[3,17]。目前，有学者研究认为，雷氏普罗威登斯菌是条件致病菌，作为一种“人-兽-鱼”共患病病原菌，主要导致心包炎、腹泻、腹水等症状[18-19]。Zhang等[20]研究报道，雷氏普罗威登斯菌自然感染蚕导致败血症。最近，国内学者从猪内脏器官、粪便样品中分离得到雷氏普罗威登斯菌[3,15]，并且证实对小鼠有较强致病性。也有报道雷氏普罗威登斯菌污染引起人食物中毒现象[21]。

注： A为眼睛肿大; B为黏液增多Note: A,eyes are swollen; B, increased mucus图3 发病巴西龟症状Fig.3 Symptom of the turtle Trachemys scriptaelegans

注： A为患病巴西龟; B为健康巴西龟Note:A,diseased turtle; B,healthy turtle图4 巴西龟眼睑组织病理染色结果Fig.4 Pathological observation of turtle Trachemys scriptaelegans with ophthalmia

近几年，关于雷氏普罗威登斯菌引发水产动物疾病等相关研究较受关注[3-8]。王建峰等[22]从国外船舶压舱水中分离出雷氏普罗威登菌。Faisal等[4]等报道罗非鱼发生大量死亡，病鱼鳃发白、肿胀，严重腹水，并在病死鱼的心、肾和脾中分离得到雷氏普罗威登斯菌。战文斌等[6]在发病的中国对虾淋巴液中分离出雷氏普罗威登斯菌，认为该菌是对虾细菌性败血症的病原。Bejarano等[5]研究表明，雷氏普罗威登斯菌是人工养殖鲢大量死亡的主要原因。陈永林等[23]从海洋馆病死白鳍鲨Triaenodonobesus腹腔脓液、心血中分离到一株致病性雷氏普罗威登斯菌。李林俐等[8]报道扬子鳄发病死亡，从其肝脏和血液中分离出雷氏普罗威登斯菌。范红结等[7]从患病中华鳖肝、脾和肺中分离出相同的病原菌，经鉴定为雷氏普罗威登斯菌，主要表现为鳖底板出血，肺、脾等内脏干酪样结节等临床症状。本试验中，从发病巴西龟眼部分泌液中分离到一株雷氏普罗威登斯菌G0503菌株，进行了细菌形态学、生理生化、16S rDNA测序及系统发育树分析，人工感染巴西龟主要呈现眼睛发炎肿大、反应呆滞、摄食减少或停止摄食等临床症状，组织染色观察发现，病龟出现眼睑组织上皮细胞中的多边形细胞消失，色素细胞增多等病理变化。

3.2 雷氏普罗威登斯菌的药敏特性

由于抗生素药物在水产养殖和疾病防控中的广泛应用，且滥用药物现象时有发生，从而使鱼类疾病防治面临着新的挑战与难题[6,8]。夏淑等[24]研究报道，人类雷氏普罗威登斯菌对喹诺酮类、β内酰胺类及碳青霉烯类等抗生素耐药。战文斌等[6]研究表明，虾源雷氏普罗威登斯菌对羧苄青霉素、头孢唑啉、复方新诺明、链霉素等药物敏感，但对新生霉素和红霉素等耐药。陈永林等[23]对白鳍鲨雷氏普罗威登斯菌进行药敏试验，结果显示其对头孢曲松、头孢哌酮和诺氟沙星等抗生素敏感。李林俐等[8]对扬子鳄雷氏普罗威登斯菌进行药敏试验，结果显示其对头孢噻肟、头孢哌酮、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺异恶唑和复方新诺明等多种抗生素敏感。由此可见，人源雷氏普罗威登斯菌对喹诺酮类、碳青霉烯类等药敏特性与水产动物源雷氏普罗威登斯菌存在明显差异，这可能与菌株来源、地域分布和临床用药有关[8,24]。本研究中，对龟源雷氏普罗威登斯菌G0503菌株进行药敏试验，结果表明，该菌对头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、磺胺异恶唑、复方新诺明等耐药。研究表明，水产动物雷氏普罗威登斯菌对头孢菌素类、喹诺酮类及氟苯尼考等抗生素敏感[6,8]，这与本试验中巴西龟雷氏普罗威登斯菌的药敏试验结果基本一致。以上研究报道了雷氏普罗威登斯菌药敏特性，可为水产动物疾病防治提供参考依据。

4 结语

本研究中从患病巴西龟眼内分离到1株雷氏普罗威登斯菌，药敏试验结果显示，该菌对头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、诺氟沙星、左氟沙星、氟苯尼考等药物敏感；人工回归感染证实，该菌对巴西龟有致死性，并且导致眼睑等组织病理变化。本研究结果不仅为龟类细菌性疾病防治提供科学依据，而且对雷氏普罗威登斯菌感染龟鳖类水生动物的致病机理研究进行了有益的探索。