miRNA的研究进度与问题总结

王绎尊

摘 要：MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20～24个核苷酸的小RNA，目前动植物的miRNA研究已经开展多年，几个miRNAs也可以调节同一个基因，机体可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达，进而产生某些特定的性状。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。本文针对目前国内外对于miRNA的研究手段及研究过程中所遇到的问题进行论述，展望未来miRNA的发展。

关键词：miRNA；northen blot；荧光定量PCR；miRNA芯片

研究目的：一小部分miRNA被发现有着调节细胞生长，组织分化的作用，因而与生命过程中发育，疾病有关。例如，miR-273和ly56，编码的miRNA的研究在医学上是一个极受关注的领域。

一、研究背景

DNA、RNA和蛋白质是生命科学研究的三大主体，DNA、RNA和蛋白质之间的关系是经典和现代化法则的核心内容；通常情况下，RNA是DNA和蛋白质之间的“过渡”。近年来的研究表明，RNA在生命进程中扮演的角色远比我们早年设想的更为重要。

二、主要研究手段

northen blot（诺瑟杂交）：Northen blot（诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northen blot首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。

荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应）：荧光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是1996 年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，而荧光定量PCR对检测miRNA主要有两种比较常见的手段：①TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解，荧光基团与淬灭基团分离，发出可被检测到的荧光，以此来监测整个PCR过程；②SYBR荧光染料法：该方法利用了SYBRGreen荧光染料非特异性与双链DNA结合并发光的特性检测PCR的全部进程，从而判定初始RNA的量。

三、研究手段对比

Norhten blot相对荧光定量PCR会比较精确，但是相对操作难度较大，由于需要采用琼脂糖凝胶电泳，随后将其原位转移至固相支持物上，再用放射性（或非放射性）标记的12DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影，实验步骤繁杂，而且由于存在转移和杂交过程，可能会对实验结果存在影响。

四、研究方向

多种miRNA的功能和miRNA的可调控性。

五、目前的研究进度

目前大多数miRNA的功能仍然是个谜，人们发现了小部分但较富有价值的miRNA的功能，如1L-21 miRNA（限制一种最常见形式的艾滋病毒的复制），Mirc19（在衰老过程中调控造血干细胞的维持和生存），并且一些miRNA具有多种功能，有些miRNA甚至具有功能选择性，发表在大学的研究团队对人类和小鼠基因组中的初级miRNA的转录本进行了全面注释。DROSHA酶在miRNA的加工中负责剪切pri-miRNA。研究人员用一个显性负突变的DROSHA稳定了人类和小鼠细胞中的pti-miRNA。随后他们对细胞核RNA进行了深度测序，并通过计算工具StringTie来组装转录本。研究通过这种方式，注释了69%的人类miRNA和75%的白鼠miRNA。过去人们普遍认为，簇集在一起的miRNA是共转录的。但研究人员发现，一些miRNA簇其实具有选择性启动子，这令研究人员十分吃惊。研究进度几乎可以认为直接取决于目前的技术水平，而由上文的研究手段可以看出，目前对miRNA的研究只停留在探测阶段，甚至对miRNA的探测技术也并不完善，northen blot与荧光定量PCR这两种技术对miRNA的探测仍然有很大的缺陷和误差，已被发现的miRNA的功能种类相对于整个miRNA体系可谓是沧海一栗，而且每个miRNA的功能都很强大，不可能直接将miRNA应用到医学中，因此miRNA的研究仍然有很大空间。

六、目前已发现的部分miRNA及其作用

调控疾病的发生与发展。疾病、相关miRNAs 、流感 miR-21，miR-223 、丙型肝炎miR-122，miR-155 、艾滋病 miR-28，miR-125b，miR-223，miR-382、二型miR-144，miR-150，miR-182，miR-103，miR-107、系統性红斑狼疮 miR-146a。

七、未来观望

目前一部分miRNA的功能的认知缺乏是由于现代的技术限制，northern blot为检测miRNA的主要手段，缺点为敏感度低（许多mblot为检测miRNA的主要手段，缺点为敏感度低（许多miRNA都可能检测不到），耗时长，RNA的用量较大。另一种方法为荧光定量PCR，相对northern blot的半定量技术，荧光定量PCR为精确定量，但耗材较贵，也只能探究mblot的半定量技术，荧光定量PCR为精确定量，但耗材较贵，也只能探究miRNA的量。而最可能与最首要的便是改变对miRNA的研究技术，目前除了northen blot和荧光定量PCR这两种主要技术外，还存在一种技术叫做Agilent miRNA芯片（Agilent miRNA芯片是miRNA芯片中的一种，也存在其他miRNA芯片，因为Agilent miRNA芯片缺点更少，故以该技术为例），相对与northen blot与荧光定量PCR而言，Agilent miRNA芯片具有以下优点：①特殊的探针设计，保证只识别成熟miRNA；②高灵敏度，可识别一个碱基差异，检测下限<0.1amol；③宽的动态检测范围：检测丰度跨5～6个logs，有利于检测到更宽丰度范围的miRNA；④高重复探针，每个miRNA重复约20次，数据更精准；⑤样品需求量低，只需要100mg总miRNA；⑥不需要分离miRNA，避免丢失及引起误差。

八、结论

miRNA芯片技术是针对miRNA研发的，相对northen blot与荧光定量PCR对miRNA的检测也更加专业与深入，未来的miRNA研究技术极大可能是以这种mirRNA芯片技术为基础来研发的，但目前由于miRNA芯片技术大多被商业化，以及基金问题，miRNA芯片技术没有及时得到推广，但未来这种技术可能会随着基金的增长与该技术的不断改进被普及，相信不久后，miRNA的研究又会更上一个台阶。

参考文献

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