重组截短型TGF—β前体潜在相关肽的原核表达及其对HSC—T6细胞增殖的影响

石永萍 郑俊雅 刘增瑞 李鲁新 王晶 李玲玉 曹雅男 初彦辉

[摘要]目的 初步研究截短型TGF-β前體潜在相关肽（LAP）的重组蛋白对HSC-T6 细胞增殖的影响。方法 PCR扩增截短型LAP片段，构建该片段的原核表达载体，经双酶切、DNA测序鉴定后，IPTG 0.5 mmol/L，37℃，4 h诱导出蛋白的大量表达，表达的蛋白经SDS-PAGE，Western blot检测，经镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白， 将重组蛋白作用于大鼠肝星状细胞-T6（HSC-T6），用MTT法检测不同浓度重组蛋白对细胞增殖作用的影响。结果 原核表达载体构建成功，成功表达、纯化了重组蛋白，且HSC-T6细胞的增殖程度随重组蛋白浓度的增加而降低。结论 重组蛋白可抑制HSC-T6细胞的增殖，为后续研究LAP片段对TGF-β活化过程的干扰作用及对器官纤维化的影响奠定基础。

[关键词]TGF-β前体潜在相关肽；原核表达；蛋白纯化；HSC-T6；增殖

[中图分类号] R331 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）6（b）-0004-04

Prokaryotic expression of latency-associated peptide of recombinant truncated TGF-β precursor and its influence on proliferation of HSC-T6 cell

SHI Yong-ping1，2 ZHENG Jun-ya1 LIU Zeng-rui1 LI Lu-xin1 WANG Jing1 LI Ling-yu1 CAO Ya-nan1 CHU Yan-hui1

1.Medical Research Center，Mudanjiang Medical College，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China；2.Inspection and Legal Affairs Section，Mudanjiang Public Health Inspection Institution，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China

[Abstract]Objective To preliminarily study the influence of recombinant protein of latency-associated peptide （LAP） of recombinant truncated TGF-β precursor on proliferation of hepatic stellate cells （HSC）-T6.Methods The truncated LAP fragment was amplified by polymerase chain reaction （PCR） and the prokaryotic expression vector was constructed.After double enzyme digestion and DNA sequencing，the protein expression was induced by IPTG at 0.5 mmol/L at 37°C for 4 h.The expressed protein was detected by SDS-PAGE and Western blot，after that the recombinant protein was by nickel agarose affinity chromatography for purification.The recombinant protein was applied to rat hepatic stellate cell-T6 （HSC-T6），and the influence of different concentrations of recombinant protein on cell proliferation was detected by MTT assay.Results The prokaryotic expression vector was successfully constructed and the recombinant protein was expressed and purified successfully.The proliferation of HSC-T6 cells decreased with the increase of the recombinant protein concentration.Conclusion The recombinant protein inhibits the proliferation of HSC-T6 cells，and lays the foundation for the subsequent study on the interference of LAP fragments on the activation of TGF-β and the influence on organ fibrosis.

[Key words]Latency-associated peptide of recombinant truncated TGF-β precursor；Prokaryotic expression；Protein purification；Hepatic stellate cells-T6；Proliferation

转化生长因子-β（TGF-β）具有多种生物学功能，促纤维化是其最重要的功能之一，被大多数学者公认为纤维化形成与发展的启动枢纽[1-3]。TGF-β的活化过程是其发挥正常功能的关键步骤，是一个受多种因素影响的复杂过程，在纤维化性疾病的发生、发展中起重要作用[4-6]。TGF-β的活化在细胞外完成，是受多种因素影响的复杂过程。在胞内，TGF-β的各种异构体都是由各个独立基因产生的，先是被合成前体蛋白，然后在内肽酶、Furin 酶作用下产生TGF-β蛋白N端的二聚体潜在相关肽（LAP）和C端的二聚体成熟型TGF-β，这两部分以非共价形式相连，即TGF-β与LAP的复合物，它不具有生物活性[7-9]。LAP上的半胱氨酸富集区能够结合TGF-β功能区，并且LAP上具有结合潜在TGF-β 结合蛋白（LTBP）和整合素的识别区域[10-11]，TGF-β与LAP的复合物被分泌到细胞外后，经过复杂的过程，并在LTBP、整合素、BMP、活性氧等的作用下，LAP被祛除或发生构型改变，导致复合物瓦解，方可释放具有生物活性的TGF-β，TGF-β通过与细胞膜表面特异性受体结合才能发挥生物学效应[12-15]。本实验以人源LAP蛋白为研究对象，希望构建一种能与TGF-β高效结合的截短型LAP片段，即能高效地与野生型LAP竞争结合TGF-β，在TGF-β活化的起始阶段干扰TGF-β的活化，进而抑制TGF-β信号传导。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；RNA提取试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司；PCR相关试剂购自日本东洋纺公司；XholⅠ、EcoRⅠ、T4连接酶及Buffer购自宝生物工程大连有限公司；引物、非干扰型蛋白定量试剂盒、W-TMB显色试剂盒均由上海生工生物工程股份有限公司产品。PCR仪，离心机，均为德国Eppendorf公司产品。

1.2 人源LAP截短型片段的扩增

依据Gene Bank数据库中LAP的cDNA序列设计引物，为方便克隆在上下游引物的5′端加入XholⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，上游引物5′-AGTGGACATCAACGGGTTC-3′，下游引物5′-CCAGTGTGTTATCCCTGCT-3′。按RNA提取试剂盒提人血总RNA，逆转录成cDNA，并以此为模板扩增基因片段。反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

1.3 原核表达载体的构建

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA回收试剂盒回收产物，回收的基因和载体pET28a分别用限制性内切酶XholⅠ、EcoRⅠ双酶切。回收酶切产物后连接载体与基因片段，得到pET28a-LAP-B2重组质粒。将重组质粒转化至感受态DH5α，将连接产物涂布于卡那霉素抗性的LB平板培养基上，烘箱37℃培养12 h。挑取单克隆菌落摇菌过夜，抽提质粒进行双酶切鉴定，并将阳性克隆测序。

1.4 重组蛋白的原核表达

将测序正确的重组质粒转化至感受态大肠埃希菌BL21，挑取单菌落于5 ml LB培养基中，37℃，220 r/min过夜培养。将过夜培养的菌液按1∶100比例分别接种于10 ml的LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养至OD值为0.6时，添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min，分别20℃诱导过夜，37℃诱导4 h，未加IPTG组为阴性对照，选择最佳的诱导条件。诱导后收集菌体用PBS缓冲液悬浮，超声破碎菌体，离心分别收集上清和沉淀，沉淀用包涵体溶解液溶解，用12%的SDS-PAGE胶电泳检测，电泳结束后用考马斯亮蓝染色。

1.5 重组蛋白的纯化

按表达量最高的条件大量诱导表达重组蛋白后，用PBS将收集的菌体重悬，冰浴超声破碎菌体，12 000 r/min，4℃，离心20 min，收集上清进行纯化。用镍琼脂糖亲和层析法纯化，用20、50、500 mmol/L的咪唑梯度洗脱，将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，将纯度最好的洗脱组分经透析膜透析2 h后再经滤膜过滤、分装，-80℃保存。SDS-PAGE电泳和Western blot检测纯化后的蛋白，并使用SK3071非干扰型蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.6大鼠肝星状细胞- T6（HSC-T6）的增殖检测

MTT实验设有正常对照组、模型组、重组蛋白作用组7组（5、10、25、50、75、100、200 ng/ml）、空白对照组，除正常对照组和空白组外，其他组均加入10 ng/ml的 TGF-β活化细胞。每组5个复孔，按每孔8×103细胞种至3个96孔板中，培养至贴壁后加入药物，分别培养12、24、48 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT，培养4 h后弃培养液，加入150 μl DMSO震荡10 min，用酶联仪测试490 nm处吸光度值（OD）。

2 结果

2.1 LAP截短片段的扩增

人源LAP片段为747 bp，实验设计的截短片段为171 bp，PCR扩增后，结果显示产物条带大小为171 bp，与实验设计一致（图1）。

2.2 原核表达载体鉴定

抽提阳性克隆菌液质粒，用XholI、EcoRI双酶切， 酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，分别产生171 bp和5369 bp的条带，与目的片段和载体大小相符（图2）。阳性克隆重组质粒送于上海生工生物工程有限公司测序，测序结果表明插入的序列与Genebank公布的序列一致（图3）。

2.3 重组蛋白的表达和纯化

经IPTG诱导表达，发现重组蛋白以包涵体形式大量存在于37℃诱导4 h的菌体沉淀中（图4），分子量大小为10.3 KD，与预期目的蛋白分子量一致，可进一步纯化。将收集的菌体用破碎Buffer溶解（2 mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-114，1 mmol/L DTT，pH 8.0），冰浴超声破碎菌体，用镍柱纯化重组蛋白，利用咪唑梯度洗脱，收集洗脱液。SDS-PAGE检查从包涵体中纯化出了目的蛋白（图5）。

重组蛋白经过纯化，SDS-PAGE电泳分析在相应位置出现明显条带，表明重组蛋白成功得到了纯化（图6）。蛋白经Western blot检测在相应位置出现明显条带（图7），用W-TMB显色试剂盒显色，经测定蛋白浓度>85%。

2.4 MTT检测细胞增殖结果

不同浓度的重组蛋白作用于HSC-T6细胞，不同时间测其OD490值，其OD490值均低于TGF-β活化組，并随重组蛋白浓度加大，作用时间的延长，其OD490值逐渐降低，呈现时间-剂量依赖性（图8）。

3讨论

TGF-β具有广泛的生物学功能，TGF-β的活化过程是其发挥正常功能的关键步骤，是一个受多种因素影响的复杂过程[16-17]。本试验以TGF-β活化过程的相关蛋白LAP为研究对象，构建了LAP片段的原核表达载体，经IPTG诱导，重组蛋白在包涵体中大量表达，包涵体表达能在一定程度上保持表达产物的结构稳定[18-20]，并从包涵体中成功纯化出目的蛋白，用Western blot确定了表达的特异性，并对蛋白的表达和纯化条件进行了优化，经纯化后获得了纯度>85%的重组蛋白。将重组蛋白作用于HSC-T6细胞，发现其显著抑制了该细胞的增殖，这为后续研究人源LAP片段重组多肽对TGF-β活化过程的干扰，以及研究其对TGF-β生物学功能的影响提供有利的保障，并为纤维化疾病的研究和治疗提供新思路。

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（收稿日期：2018-03-23 本文編辑：许俊琴）