小鼠Mterf2基因cDNA的克隆、序列分析与组织表达特征

李素芬，王唯斯，自加吉，陈莹，戴莉萍，余敏，熊伟

1.大理大学 基础医学院，云南 大理 671000；2.大理州人民医院 病理科，云南 大理 671000；3.云南大学 生命科学学院，云南 昆明 530061

线粒体转录终止因子（mitochondrial transcrip⁃tion termination factors，MTERFs）是一类由核基因编码且定位于线粒体，具有MTERF结构域的蛋白质，广泛存在于后生动物和植物中[1-3]。线粒体转录终止因子2（MTERF2）又称线粒体转录终止因子结构域3（mitochondrial transcription termination factor domain-containing 3，MTERFD3），是MTERF蛋白家族成员[4]。Mterf2基因是在比较血清饥饿与血清培养的人类成纤维细胞的基因表达谱差异时发现的一个细胞增殖抑制基因[5]。检索NCBI数据库发现，小鼠Mterf2基因定位于10C1，含有4个外显子。Mterf2mRNA的开放读框（ORF）为1158 bp，其编码的蛋白质由385个氨基酸残基组成。目前，关于小鼠Mterf2基因在动物体内组织中的表达尚未见研究报道。在本研究中，我们通过RT-PCR克隆小鼠Mterf2基因的cDNA序列，利用MEGA 6.0软件构建Mterf2基因系统发生树，采用Northern印迹和qRT-PCR方法检测Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠各组织中的表达，Western印迹检测MTERF2蛋白在小鼠各组织中的表达。本研究探索了Mterf2基因在BALB/c小鼠不同组织中的表达规律，为进一步研究Mterf2基因在动物体内的生物学功能奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α感受态细胞、组织RNA保存液、焦碳酸二乙酯（DEPC）购自北京天根生物科技有限公司；pMD19-T克隆载体、RNAiso Plus提取试剂盒、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒、限制性核酸内切酶Hind Ⅲ 和BamHⅠ、T4DNA连接酶购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；琼脂糖、Trans 2K DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；荧光定量PCR染料SYBR Premix ExTaq购自南京诺唯赞生物科技有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、RIPA组织细胞裂解液、SDS-PAGE配胶试剂盒、4×蛋白质上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；二辛可宁酸（BCA）法蛋白质定量试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；质粒DNA提取试剂盒、柱式PCR产物纯化试剂盒购自Omega公司；增强型化学发光（ECL）试剂盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自Millipore公司；兔抗MTERFD3单克隆抗体（ab230128）、兔抗 GAPDH单克隆抗体（ab181602）、HRP标记的山羊抗兔IgG（ab6721）购自Abcam公司；分析纯级异丙醇、无水乙醇和75% 乙醇购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；PCR引物和cDNA探针由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 实验动物及处理

健康清洁级BALB/c小鼠8只，雄性，40 d龄，平均每只体重30.0±4.1 g，由昆明医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号码为SCXK（滇）2016-0002。

处死小鼠前禁食12 h，仅供饮水。颈椎脱臼处死动物，取心、脑、脾、肺、肾、肝、胰腺、肌肉和睾丸等9种组织，每样组织标本约100 mg，分别放入含500 μL RNA保存液的1.5 mL EP管中备用。组织样本采集均于处死动物后30 min内完成，所用解剖工具和EP管均用0.1% DEPC水浸泡过夜后高温高压消毒[6]。

1.3 小鼠各组织总RNA提取和cDNA合成

选用BALB/c小鼠的9种不同组织，各取100 mg组织样本在无RNase的碾磨器中匀浆后用RNA提取试剂盒RNAiso Plus提取各组织的总RNA，1.5% 琼脂糖凝胶电泳验证总RNA的完整性，用Nanodrop One UV/Vis微量核酸蛋白定量仪测定各样品的总RNA浓度，每个样本重复测量3次，取平均值。在经DEPC处理的0.2 mL离心管中加入小鼠各组织的总RNA 4 μL，分别加入1 μL Random Primer（100 μmol/L）和 1 μL Oligo（dT）18（100 μmol/L），用无RNase的ddH2O将体系补足至12 μL，混合均匀后短暂离心，65℃孵育5 min，迅速置于冰上，向反应体系中加入5×MMuLV 缓冲液4μL、dNTPs（10 μmol/L）2 μL、RNase抑制剂（5 U/μL）1 μL、M-MuLV反转录酶（5 U/μL）1 μL，使反应总体积为 20 μL，混合均匀后短暂离心，于42℃温育60 min，75℃ 5 min以灭活逆转录酶，然后将制备的cDNA置于-80℃冰箱中保存备用。

1.4 小鼠Mterf2基因cDNA编码区的克隆及序列分析

PCR扩增引物参照GenBank公布的Mterf2mRNA序列（NM_172135.2），采用Oligo 7.56软件设计。Mterf2基因cDNA编码区序列（CDS）上游扩增引物为 5′-ATGCCGTGGAGGTTGCCGA-3′，下游扩增引物为 5′-TCACTCTTCAACCTTTAATG-3′。以BALB/c小鼠肝组织cDNA为模板进行PCR扩增（反应条件：95℃预变性 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环；72℃延伸 5 min），用柱式PCR产物纯化试剂盒回收扩增产物中的目的片段，与pMD19-T克隆载体连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，扩大培养细菌，菌液PCR鉴定后，提取阳性克隆质粒并进行酶切鉴定[7]。将阳性克隆的重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果用Lasergene 7.0软件进行序列分析及同源性比对。

1.5 小鼠Mterf2基因的系统发生分析

从NCBI GenBank数据库下载智人（Homo sa⁃piens，NM_025198.4）、黑猩猩（Pan troglodytes，XM_009426159.2）、大 鼠（Rattusnorvegicus，NM_001014265.2）、牛（Bos taurus，NM_001191174.1）、马（Equuscaballus，XM_023631006.1）、非 洲 爪 蛙（Xenopus tropicalis，XM_002942200.4）、斑马鱼（Danio rerio，NM_001044828.2）等7个物种的Mterf2基因同源cDNA序列，用MEGA 6.0软件分析，邻接法构建小鼠Mterf2基因的系统发生树。

1.6 Northern印迹检测小鼠不同组织中Mterf2 mRNA的表达差异

利用抽提的BALB/c小鼠各组织总RNA，采用Sambrook等的方法进行Northern转膜和杂交[8]。将20 μg总RNA在1.5% 变性琼脂糖凝胶上电泳分开，转移到硝酸纤维素膜上，以α-［32P］dCTP标记的Mterf2cDNA片段为探针进行分子杂交（杂交条件为68℃，16 h），用1×SSC、0.2% SDS于68℃洗 15 min，再用 0.5×SSC、0.1% SDS于 68℃洗 15 min，将洗好的膜置于80℃烘干后压X线胶片曝光。同样方法，以β-actincDNA为探针再次进行Northern印迹，作为内参对照。

1.7 实时荧光定量PCR检测小鼠不同组织中Mterf2 mRNA的表达量

采用 SYBR GreenⅠ染料法，以小鼠GAPDH为内参基因，目的基因、内参基因的质粒标准品为阳性对照，ddH2O为阴性对照，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，在Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增和数据分析。实时荧光定量RT-PCR引物见表1。实时荧光定量PCR体系（20.0 μL）包括2×SYBR Premix ExTaq10.0 μL，Primer-F（10 μmol/L）、Primer-R（10 μmol/L）各 0.5 μL，模板 3.0 μL，用 ddH2O 补足至 20.0 μL。PCR 程序：95℃预变性 5 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，40 个循环。实验重复3次。

1.8 Western印迹检测小鼠不同组织中MTERF2蛋白表达量

取小鼠各组织标本100 mg，分别加入1 mLRIPA裂解液（含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂），提取总蛋白，4℃、12 000 r/min离心10 min，转移上清液至新的EP管中，采用BCA法测定提取的蛋白质浓度。取各组织的总蛋白样品30 μg与4×蛋白质上样缓冲液混匀，煮沸10 min；将已处理的蛋白质样品进行12% 的SDS-PAGE，电泳结束后用Trans-Blot Turbo蛋白质转印仪20 V电压转膜7 min，50 g/L脱脂牛奶封闭2 h；加入用封闭液1∶1000稀释的兔抗MTERFD3单抗，兔抗GAPDH单抗，4℃孵育过夜；TBS-T洗涤PVDF膜10 min，换液，重复3次；加入用封闭液1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h；TBS-T洗涤3次，ECL化学发光液显色。用Chemi⁃Doc XRS+化学发光成像系统成像并拍照，用系统配置的Image Lab 5.2.1软件计算蛋白质条带的灰度值，以MTERF2/GAPDH的灰度值比值表示MTERF2蛋白的相对表达量。实验重复3次。

表1 实时荧光定量RT-PCR的引物

1.9 统计学分析

数据以x±s表示，采用GraphPad Prism 5.01软件进行统计学处理，两样本均值间的比较采用t检验，多样本均值间采用One-way ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 小鼠Mterf2基因cDNA编码区序列的RTPCR扩增

以BALB/c小鼠肝组织总RNA反转录后的cDNA为模板，Mterf2基因cDNA CDS扩增产物的凝胶电泳结果见图1，RT-PCR扩增片段约为1158 bp，与预期一致。

图1 BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA编码区序列的克隆

2.2 重组质粒的PCR和双酶切鉴定

对转化有pMD19-T-Mterf2的大肠杆菌进行菌液PCR扩增电泳检测，提取重组质粒用HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定。结果显示，菌液PCR产物位置与阳性对照结果一致，大小与预期片段相符（图2）；重组质粒双酶切产物大小分别与目的基因片段及pMD19-T载体大小相符（图3）。

图2 菌液PCR结果

图3 重组质粒双酶切电泳结果

2.3 小鼠Mterf2基因系统发生分析

将阳性克隆含有的重组质粒送上海生工生物工程公司进行DNA测序，结果显示BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA编码区序列全长1158 bp，编码385个氨基酸残基，与GenBank参考序列（NM_028832.3）的同源性达100% ，无任何碱基突变和移码突变。用MEGA 6.0软件构建Mterf2基因系统发生树发现，小鼠Mterf2基因与大鼠Mterf2基因序列的同源性最高，达到91.0% ，说明两者进化关系最近，聚类为一簇（图4），其次与人、黑猩猩、牛和马聚类为一簇，最后与非洲爪蛙聚类。小鼠Mterf2基因与人Mterf2基因的同源性为80.3% ，进化关系相对较远。

图4 邻接法构建不同物种Mterf2基因的核苷酸序列系统发生树

2.4 Nothern印迹检测小鼠各组织中Mterf2基因mRNA表达差异

Nothern印迹检测结果见图5，小鼠Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠不同组织中均有不同程度的表达，尤其是在新陈代谢旺盛的组织，如大脑、心、肝、肾等组织中表达程度较高，但在肺和脾中的表达程度较低。

图5 Nothern印迹检测Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠不同组织中的表达

2.5 小鼠Mterf2基因mRNA的组织表达谱分析

分别以BALB/c小鼠不同组织的cDNA为模板，用qRT-PCR检测GAPDH和Mterf2基因的表达情况。样品曲线均在循环结束前进入平台期。Mterf2和GAPDH基因的扩增曲线和熔解曲线均达到实验要求（图6A、B）。qRT-PCR结果显示，Mterf2基因在BALB/c小鼠大脑、心脏、肝脏和肾脏中的表达量较高，其次是睾丸、胰腺和肌肉组织，而在肺脏和脾脏组织中的表达量相对较低。以大脑组织中Mterf2基因mRNA表达量为对照组，用Graphpad Prism 5.01软件对荧光定量结果求平均数、标准差，作柱状图（图6C）。

2.6 小鼠MTERF2蛋白的组织表达谱分析

Western印迹检测BALB/c小鼠MTERF2蛋白在各组织中的表达，结果见图7，MTERF2蛋白在小鼠大脑、心、肝和肾组织中的表达量较高，其次是睾丸、胰腺和肌肉组织，而在肺和脾组织中的表达量相对较低。以大脑组织中MTERF2蛋白表达量为对照组，Western印迹定量结果与荧光定量RT-PCR检测结果基本一致。

3 讨论

线粒体转录终止因子蛋白家族各成员参与线粒体基因复制、转录及翻译的调控[9]。MTERF蛋白家族成员有2个显著特征，即定位于线粒体和存在不定重复数的MTERF结构域[10]。人Mterf2基因是2003年Chen等在比较血清培养细胞及血清饥饿细胞的基因表达差异时首次被克隆。人MTERF2与MTERF1蛋白的氨基酸序列有52% 的同源性，并具有MTERF家族共有的亮氨酸拉链结构[5]。MTERF2能够抑制线粒体基因的复制和转录，对细胞的生长及增殖具有负调控作用[11-12]。过表达Mterf2基因将细胞的增殖阻滞于G1和S期之间[13]。研究表明，MTERF2不仅是一个非序列特异性的线粒体DNA（mtDNA）结合的蛋白质，而且是参与线粒体类核的组成的重要蛋白质[14]。MTERF2在哺乳动物mtDNA转录调控中并非必要的转录因子，但却是生理应激响应时调控线粒体转录的关键因子[14]。

图6 qRT-PCR检测Mterf2基因mRNA在BALB/c小鼠不同组织中的相对表达量

图7 Western印迹检测MTERF2蛋白在BALB/c小鼠不同组织中的相对表达量

2006年，Luca等首次克隆和鉴定了小鼠Mterf2基因,并通过免疫荧光技术证实MTERF2蛋白定位于线粒体，是一个典型的核基因编码的线粒体蛋白质[15]。BALB/c小鼠是目前常用的实验动物，广泛应用于免疫学、生理学等研究，Mterf2基因在BALB/c小鼠中的组织表达谱尚不清楚。本研究首次从BALB/c小鼠中克隆到小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列，并检测到Mterf2基因在BALB/c小鼠各组织中的表达程度不同，通过Northern印迹、荧光定量RT-PCR和Western印迹等方法对Mterf2基因的表达量进行了分析。结果表明，Mterf2基因在BALB/c小鼠大脑、心脏、肝脏和肾脏组织中的表达量较高，其次是胰腺、睾丸和肌肉组织，而在肺脏和脾脏组织中的表达量相对较低。张林冰等检测MTERFs蛋白在C57BL小黑鼠脑、肝和肾组织中的表达情况，发现在脑组织中的表达水平最高，高于肝组织和肾组织；MTERF2蛋白在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中的表达高于人心肌细胞HCM[16]。Han等也发现，在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中，MTERF2蛋白能促进1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导引起的线粒体功能障碍和细胞损伤[17]。我们的研究结果表明，Mterf2基因在BALB/c小鼠体内的表达具有组织特异性，在线粒体含量丰富且代谢旺盛的组织中高表达。值得注意的是，不同的遗传背景可能会导致Mterf2基因表达谱的改变，在利用BALB/c小鼠作为研究人类疾病的动物模型时，应加以考虑[18]。

总之，本研究为探索Mterf2基因在实验动物体内的生物学功能奠定了基础，同时，我们推测Mterf2基因在各组织中的表达情况可能与小鼠品系、营养水平及饲养环境等影响因素有关，这有待于进一步研究。