换液频率对关节软骨体外保存效果的影响*

韩运宁，亓建洪，曲鹏玮，张凯红，毕懿康，周路，宋洪强，谢地

(泰山医学院 运动医学研究所，山东 泰安 271000)

1 引 言

膝关节软骨损伤是最常见的运动损伤之一，由于膝关节软骨无血管神经分布，一旦损伤很难完成自身修复。同种异体软骨来源广泛，移植后无排斥反应，可形成符合生物力学要求的透明软骨，成为治疗软骨缺损的理想方法。同种异体软骨移植术在美国应用广泛，临床跟踪研究显示同种异体软骨移植手术的成功率达到75%以上[1]，79%的患者可以恢复到受伤前的运动水平[2]。软骨移植物在移植前需要进行常规的病原微生物检测，该过程至少需要7 d，而随着时间的延长，软骨细胞存活率会逐渐下降。文献[3]报道只有当体外软骨细胞存活率达到70%以上，才能保证移植后的手术效果。如何在保证软骨细胞达到较高存活率的情况下延长体外保存时间，成为同种异体软骨移植手术能否大量应用的关键。软骨组织体外保存时的细胞活性受多种因素影响。换液频率与软骨细胞的新陈代谢密切相关，同时软骨保存过程中保存液的用量也与换液频率有关，筛选出合适的换液频率可以维持保存过程中软骨细胞的活性，同时有利于降低软骨库及软骨移植手术的成本。因此，我们研究应用组织培养法时，换液频率对关节软骨体外保存效果的影响。

2 材料和方法

2.1 材料

选择来自附近农场的体重约100 kg的本地健康猪。利用专业骨软骨取材器械ARTHREX骨软骨移植器械在猪膝关节股骨髁关节面内外侧负重区获取圆柱状骨软骨块60枚，长10 mm，直径为6 mm[4]。

2.2 方法

2.2.1保存方法 保存液采用含有双抗的DMEM(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)保存液。将所取的软骨随机分为3组：A组(不换液)20枚；B组(每7 d换液)20枚；C组(每2 d换液)20枚。将软骨置于4℃条件下保存。28 d后检测软骨细胞存活率、组织形态学和生物力学性能。

2.2.2细胞存活率检测 用振动切片机垂直于软骨表面纵切成 60 um 厚的组织切片；置于50 mg/L FDA(fluorescein diacetate，FDA)溶液和10 mg/L EB(ethidium bromide，EB)溶液的混合液中染色，在荧光显微镜 450 nm 波长激光激发下观察，视野中呈现绿色的为活细胞，红色为死细胞。采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计数并计算软骨细胞存活率=(活细胞数目/活细胞与死细胞数目之和)×100%。

2.2.3形态学检测 将软骨标本用4%多聚甲醛溶液固定，然后进行脱钙，石蜡包埋，组织切片等操作。对切片进行番红O染色观察，并采用Image Pro Plus 6.0图像分析IOD值(积分光密度)，然后对染色图片进行分析比较。

2.2.4生物力学检测 使用英斯特朗生物力学测试机检测软骨的生物力学特性。预压缩压力设定为5.0 N，以0.1 mm/s的速度对样本进行检测，由力学测试软件计算出杨氏模量值进行比较。

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 细胞存活率

使用FDA-EB混合染液对切片进行染色，并用Image J图像分析软件计数活细胞和死细胞数目，计算软骨细胞存活率。由图1可见A、B、C三组软骨细胞均出现大量死亡， A组和B组死亡最多，细胞存活率仅为15.63%和16.98%。C组相对于A、B两组存活率较高，达到26.76%。经过统计分析得到图2柱状统计图，从统计图中可以看出28 d后细胞存活率比较，A组和B组之间无统计学差异，C组存活率优于A组和B组(P<0.05)。

3.2 形态学检测

图3为番红O染色图片。番红O染色可将软骨中的蛋白多糖成分染成红色。通过染色图片可以看出，A组和B组颜色浅，表明软骨基质中的蛋白多糖含量低。C组的着色要明显高于A组和B组，即C组软骨基质中的蛋白多糖含量较多。分析番红O染色图片IOD值，评价软骨蛋白多糖的含量。由图4可见A组的IOD值和B组IOD值没有明显的差别，C组IOD值高于A组和B组(P<0.05)。表明C组蛋白多糖含量要高于A组和B组。

图1FDA-EB荧光染色结果(×100倍)。绿色示活细胞；红色示死细胞。

Fig1CartilagesectionstainingwithFDA-EBfluorescence(×100magnification).greenfluorescence,viablecells;redfluorescence,deadcells

图2 A、B、C三组之间细胞存活率比较(***P<0.001)

Fig2Comparisonofthechondrocyteviabilityinthethreegroups(***P<0.001)

3.3 生物力学

由英斯特朗生物力学测试机得到各组软骨的杨氏模量。通过数据统计分析，A组和B组杨氏模量没有明显的差别，C组杨氏模量优于A组和B组(见图5)。杨氏模量反应软骨的生物力学性能， 表明C组软骨的生物力学性能最好。

图3 番红O染色结果(x40倍)

图4 各组间IOD值比较(**P<0.01)

图5 生物力学结果(**P<0.01)

4 讨论

组织培养法保存关节软骨，能够模拟体内关节软骨的营养环境，为软骨提供新陈代谢所需的营养物质，最多可以将保存期延长至65 d[5]。组织培养法保存关节软骨成为同种异体软骨移植研究的热点。目前，优化保存方案的研究主要集中于保存液成分和保存环境。Pennock等人的研究发现向EMEM培养液中加入10%的新鲜胎牛血清(FBS)可以提高保存期内软骨细胞的存活率[6]。但是异体的血清可能会引起免疫排斥反应，也会增加疾病传播的风险。向DMEM培养液中添加胰岛素样生长因子(IGF-I)也可以提高同种异体软骨的保存效果[7]。此外，还有转化生长因子(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)的抑制剂依那西普、地塞米松等，均被证实可以在不同方面提高软骨的保存效果[8-10]。对于保存环境，研究人员从温度、力学环境等方面入手进行了一系列实验。Lsprsde等人的研究发现4℃条件下可以减缓软骨细胞的代谢，维持原有的细胞外基质成分[11]。Qi等人在4℃下保存软骨并在28 d后检测软骨细胞存活率，实验结果显示4℃条件下的保存效果优于37℃条件下的保存[12]。关于最佳的保存温度还在争论中，37℃，25℃，4℃均有报道为最佳保存温度[5,11-14]，需要根据其他保存条件选择合适的保存温度。此外，模拟关节软骨体内的应力环境，在体外对软骨施加适当的力学刺激，也可以提高保存效果[15-17]。对于保存期间保存液的换液频率此前并没有报道。

虽然软骨库中保存的是骨软骨组织块，其内部细胞每时每刻都与外界进行着物质交换。筛选出合适的换液频率有利于软骨细胞汲取保存液的养分维持自身的新陈代谢，同时可以为软骨库的建立提供理论依据，减少保存液的浪费，降低软骨库运营成本。软骨细胞存活率是评价保存效果的“金标准”[3]。本研究中，由于选用了基础培养液，所以保存28 d后各组软骨细胞存活率均出现了明显的下降。但是采取每2 d换液的一组细胞存活率明显高于不换液组和每7 d换液组。正常人的软骨组织中无血管和神经，其营养成分的供给依靠关节腔中的关节液。组织培养法保存关节软骨，模拟关节软骨所处的液体环境，保存液中含有多种细胞生存所需的营养物质，可以为软骨细胞的新陈代谢提供必要的营养。蛋白多糖是关节软骨细胞外基质的重要组成成分，具高度亲水性，对保持组织水分及物质交换均有重要作用。实验中每2 d换液组的蛋白多糖含量最高，可以维持软骨组织的生物学性能。关节软骨的生物力学性能是评价软骨保存效果的重要指标，本研究中每2 d换液组的杨氏模量明显优于不换液组和每7 d换液组。有研究表明，软骨组织的基质成分变化会导致软骨的粘弹性改变[18]。每2 d换液可以维持软骨细胞外基质中的蛋白多糖含量，同时维持了软骨的生物力学性能。软骨细胞合成分泌各种细胞外基质，软骨细胞对基质的形成和维持有重要的调节作用。同时细胞外基质反过来也调节软骨细胞的功能，影响着软骨细胞的新陈代谢。

综上，组织培养法保存关节软骨时，采取每2 d更换一次培养液的方案可以提高关节软骨的体外保存效果，对以后软骨组织库的建立提供参考。