两色金鸡菊水提液微生物限度检查法实验研究

刘宏 张颖

摘要：验证药典中常规方法检测两色金鸡菊水提液中微生物限度的可行性，按照药典规定的微生物限度检查法对两色金鸡菊水提液中的菌数计数和控制菌进行检测，菌数计数结果各试验菌回收率均大于70%，控制菌检查实验组均阳性检出。结果表明实验所采取的薄膜过滤法计数和控制菌检查常规方法能正确反映检品中微生物限度的情况，适合于两色金鸡菊水提液微生物限度检查。

关键词：微生物限度；两色金鸡菊

两色金鸡菊（CoreopsistinctoriaNutt）又名血菊，维吾尔语称“古丽恰尔”，系菊科金鸡属一年生草本植物两色金鸡菊的干燥花蕾。具有活血化瘀、清热解毒、和胃健脾之功效。[1]现代研究表明，两色金鸡菊含有黄酮、皂苷、多糖、挥发油、氨基酸等成分，具有降血脂、降血压，抗衰老、降糖等药理作用。[2，3]本文对两色金鸡菊药材的微生物限度检查方法进行了探讨和研究，按照2015年药典相关规定进行方法学验证，为完善两色金鸡菊药材检测方法和微生物限度方法学探讨提供有益的科学探讨。

1材料与方法

1.1仪器与材料

MJX250型恒温培养箱由上海博迅医疗设备厂生产；蒸汽压力灭菌器由上海申安医疗设备厂生产；旋涡混合器由浙江麒麟医药设备有限公司生产；过滤器由蜀牛玻璃制品有限公司生产。枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、大肠埃希菌[CMCC（F）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]购自中国药品生物制品鉴定所；实验所用培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。两色金鸡菊药材产自新疆，购自新疆采薇飘香电子商务有限公司。

1.2实验方法

1.2.1菌液的制备

菌种经复苏后细菌移至营养琼脂培养基置培养箱中30～35℃培养24h，取新鲜培养物加0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌数为50～100cfu的菌悬液；真菌移至改良马丁琼脂培养基置培养箱中20～25℃培养7d，取新鲜培养物加0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌数为50～100cfu的菌悬液。

1.2.2供试品溶液的制备

取供试品10g，加纯化水100ml，超声30min后过滤，滤液补足至100ml备用。

1.2.3薄膜过滤法菌数计数检查

采用药典规定薄膜过滤法进行菌数计数。实验组取供试品溶液1ml加无菌蛋白胨溶液至100ml，用过滤器薄膜过滤，蛋白胨溶液冲洗滤膜2次，每次100ml，在最后一次冲洗液中加入1ml含50～100cfu的菌液，取下滤膜置于规定培养基中在规定温度下培养至规定时间，点计菌落数；菌液组为考察实验组中加入的菌液中具体菌数，过滤器仅薄膜过滤与实验组相同量的菌液，其余操作过程同实验组；供试品对照组考察供试品中所含菌数过滤器仅薄膜过滤与实验组相同量的供试品溶液，其余操作过程同实验组。回收率按照1.2.4项下計算，结果如表1所示。

1.2.4回收率计算

加菌回收率=（实验组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数*100%

1.2.5控制菌检查（大肠埃希菌和沙门菌）

取胆盐乳糖培养基3份，其中一份接种大肠埃希菌作为阳性对照，一份无添加为阴性对照，一份接种供试品溶液作为实验组，35℃培养24h后取菌液0.2ml进行MUGI实验，最后划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，观察菌落形态。

取营养肉汤培养基3份，同大肠埃希菌设置阴性和阳性对照以及实验组，35℃培养24h后增菌培养，划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，培养后观察菌落形态，随后划线TSI琼脂鞋面观察颜色特征，最后取斜面培养物进行生化试验确认。结果如表2所示。

2实验结果

2.1菌数计数实验结果

由表1可以看出，所有试验菌回收率均大于药典规定的70%，说明两色金鸡菊水提取液对所有试验菌均无明显抑制反应，不影响菌数计数过程。

2.2控制菌检查实验结果

表2可以看出控制菌检查结果PC和NC结果均正常，实验组均为阳性检出，符合药典中对于控制菌检查的要求。

综上，两色金鸡菊水提液对菌数计数和控制菌检查均无影响，药典规定的常规实验方法适合两色金鸡菊水提液的微生物限度检查技术。

3讨论

药物的微生物限度检定工作常因药物对微生物生长的抑制作用而无法准确表现药物被微生物污染的情况，所以在方法学验证在前期实验方法的确定过程中具有十分重要的意义。两色金鸡菊是规范化生产相对较新的药物，在微生物限度检查方面的研究较少，本文验证了药典中常规方法对两色金鸡菊药物水提液微生物限度检查的适合程度，因无明显的抑制微生物生长作用，故而常规实验方法可真实表现两色金鸡菊水提液中微生物污染程度，为该药物的规范化检查提供有益的科学探讨。

参考文献：

[1]张邦能，舒畅，杜玫，等.昆仑雪菊水提物对2型糖尿病小鼠血糖及胰岛素水平的影响[J].西部中医药，2016，29（1）：2629.

[2]梁淑红，庞市宾，刘晓燕，等.金鸡菊提取物降血脂作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（8）：234235.

[3]张淑鹏，李琳琳，木合布力·阿布力孜，等.昆仑雪菊提取物对α葡萄糖苷酶的抑制作用[J].现代生物医学进展，2011，11（6）：10551058.

项目：省级优秀青年人才支持计划两色金鸡菊化学成分及其降“三高”物质基础研究（gxyqZD2016505）省级创新发展行动计划药品生物检定技术精品在线开放课程