藏药铁棒锤及其习用品中3种生物碱含量测定

赵梅宇 宋良科 任瑶瑶 谭睿

摘要：目的 建立同时测定铁棒锤及其习用品中苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱的HPLC含量测定方法，为铁棒锤药材质量标准毒性成分控制及其与习用品区别提供依据。方法 采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸），梯度洗脱，检测波长235 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温25 ℃。结果 苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱分离度良好，3种成分在检测范围内均呈良好线性（r>0.999），平均加样回收率为97.66%～98.47%，RSD为0.84%～1.60%。结论 铁棒锤及其习用品中3种生物碱的含量差异较大，多裂乌头A. polyschistum、缩梗乌头A. sessiliflorum应另立药名加以区别。

关键词：铁棒锤；多裂乌头；缩梗乌头；生物碱；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.020

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0083-04

Abstract： Objective To establish a method for determining benzoylaconine， aconitine and 3-deoxyaconitine in Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials by HPLC； To provide basis for control of quality standard toxicity composition in Aconitum pendulum and difference between Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials. Methods Agilent Eclipse XDB-C18 column （250 mm × 4.6 mm，5 μm） was used at 25 ℃ with the mobile phase consisting of acetonitrile-0.04% trimethylamine （each 1000 mL of water plus 4 mL triethylamine and 1.68 mL phosphoric acid） by gradient elution； detection wavelength was 235 nm； the flow rate was 1 mL/min； injection volume was 10 μL. Results The benzoylaconine， aconitine and 3-deoxyaconitine had good separation and linear relationship in the corresponding range （r>0.999）. The average recovery rates were 97.66%–98.47%， and RSD were 0.84%–1.60%. Conclusion The contents of 3 alkaloid were different in Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials. Both A. polyschistum and A. sessiliflorum need separate drug names.

Keywords： Aconitum pendulum； A. polyschistum； A. sessiliflorum； alkaloid； content determination

榜那（Radix Aconiti）始載于藏医学巨著《四部医典》[1]，其味甘、微苦，性热，有大毒，具有驱寒止痛、祛风定惊功效，用于治疗龙病、寒病、黄水病、麻风、癫狂等。1987年版《四川中药材标准》[2]收载药材雪上一支蒿，别名铁棒锤、铁棒七、三转半：为毛茛科乌头属植物铁棒锤Aconitum pendulum、伏毛铁棒锤A. flavum、多裂乌头A. polyschistum的干燥根。

1995年版《卫生部药品标准·藏药》（第一册）[3]收载药材铁棒锤，藏药名为榜那，为毛茛科植物铁棒锤A. pendulum、伏毛铁棒锤A. flavum的干燥根。1997年，《中华藏本草》[4]收载藏药材曼钦-铁棒锤，为毛茛科乌头属植物铁棒锤A. pendulum、伏毛铁棒锤A. flavum及多裂乌头A. polyschistum等多种同属植物的干燥根。2010年版《四川中药材标准》[5]因《卫生部药品标准·藏药》已收载铁棒锤，不再收载药材雪上一支蒿（铁棒锤）。因多裂乌头A. polyschistum和缩梗乌头A. sessiliflorum在四川阿坝等藏区已长期作铁棒锤药用，而多裂乌头药用效果好，一直受到青睐。近10多年来，四川阿坝洲马尔康、若尔盖等县大量引种栽培多裂乌头A. polyschistum，并作铁棒锤销售。根据铁棒锤药效成分（也是毒性成分）主要为乌头碱、3-脱氧乌头碱、3-乙酰乌头碱、苯甲酰乌头碱等[6-7]的特点，本研究建立HPLC分析方法，对比铁棒锤及其习用品中生物碱的种类和含量，为铁棒锤质量控制和其习用品多裂乌头、缩梗乌头的资源合理利用提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1260-II型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），BS-110S型电子分析天平（北京赛多利斯电子天平有限公司），KQ-500DE型数控超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱（成都普思生物生物科技有限公司，批号分别为PS010300、PS0150-0025、PS13031302，含量≥98%），甲醇、乙腈为色谱纯（Sigma），其他试剂均为分析纯。

药材样品经西南交通大学宋良科教授鉴定为毛茛科乌头属植物铁棒锤（编号1～6），多裂乌头（编号7～9）、缩梗乌头（编号10、11），见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸），梯度洗脫（0～15 min，25%～30%乙腈；15～25 min，30%～40%乙腈；25～45 min，40%～60%乙腈），检测波长235 nm，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温25 ℃。在上述色谱条件下，供试品中苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱色谱峰保留时间与对照品一致，3个成分的色谱峰能达到较好分离，样品其他成分对待测成分的测定无干扰。各成分吸收峰理论塔板数均不低于4000，色谱峰分离度均大于1.5。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备

精密称取苯甲酰乌头碱3.03 mg、乌头碱12.17 mg、3-脱氧乌头碱3.89 mg，分别置于10 mL容量瓶中，分别加甲醇溶解并定容，摇匀。依次分别精密吸取上述对照品溶液各1 mL于同一5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL分别含苯甲酰乌头碱0.060 6 mg、乌头碱0.243 4 mg、3-脱氧乌头碱0.077 8 mg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取铁棒锤粉末（过2号筛）约2 g，精密称定，置锥形瓶中，加3 mL氨水，精密加入50 mL乙酸乙酯-异丙醇（1∶1），称定质量，超声处理（300 W，40 kHz，25 ℃以下）30 min，放冷，用乙酸乙酯-异丙醇（1∶1）混合溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入甲醇5 mL，溶解，过滤，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积，以进样量（mg）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程和相关系数。结果表明3种生物碱在相应范围内关系良好，见表2。

2.5 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱峰面积的RSD分别为1.94%、2.32%、1.67%，表明仪器精密度较好。

2.6 稳定性试验

精密称取铁棒锤样品约2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于制备后0、3、6、9、18、24 h进样，测定峰面积，计算RSD。结果苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱峰面积的RSD分别为2.15%、2.07%、1.51%，表明供试品溶液在24 h内稳定可用。

2.7 重复性试验

精密称取1号铁棒锤样品6份，每份约2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算RSD。结果苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱峰面积的RSD分别为1.27%、1.34%、2.67%，表明本试验重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称定1号铁棒锤样品6份，每份约0.8 g，分别精密加入1 mL对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，计算加样回收率。结果苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱的平均回收率分别为97.66%、98.41%、98.47%，RSD分别为1.60%、1.29%、0.84%，见表3～表5。

2.9 样品含量测定

精密称取各药材粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各样品中3种成分含量，每个样品平行试验3份，结果见表6。

3 讨论

本研究在文献[8-10]对比及本课题组前期研究基础上，将流动相优化为乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸）进行梯度洗脱，使各成分达到理想的分离，可同时测定铁棒锤中苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱的含量，具有简便、准确、重复性好的特点。该方法为铁棒锤指纹图谱的建立和药材质量控制奠定了良好基础。

苯甲酰乌头碱、乌头碱、3-脱氧乌头碱为铁棒锤Aconitum pendulum、伏毛铁棒锤A. flavum及其习用品多裂乌头A. polyschistum、缩梗乌头A. sessiliflorum的共有成分。本研究结果表明，多裂乌头的乌头碱平均含量为铁棒锤的1.4倍，而3-脱氧乌头碱的平均含量为铁棒锤的2.6倍，仅苯甲酰乌头碱的含量低于铁棒锤。苯甲酰型生物碱毒性为双酯型乌头碱的1/1500～1/150[11]，可见多裂乌头毒性（药用成分）远高于铁棒锤，又因多裂乌头A. polyschistum在四川阿坝藏区药用历史悠久，并取名三转半（药材在碗底研磨以此限量）是有药效物质基础为依据的，应另立药物名称为铁棒七或三转半，收入药材标准，解决资源利用问题。

缩梗乌头的乌头碱平均含量仅为铁棒锤的0.28倍，且3-脱氧乌头碱的含量不及铁棒锤的1/3，仅苯甲酰乌头碱的含量约为铁棒锤的1.4倍，由于单酯型乌头碱毒性远低于双酯型乌头碱，故缩梗乌头的毒性远低于铁棒锤，不宜作铁棒锤或雪上一枝蒿药用。

本研究前期对铁棒锤的名称与基源考证认为：榜那-铁棒锤药材（雪上一枝蒿）涉及毛茛科乌头属16种基源植物的块根；在藏、汉居住地或汉、藏混居区均有分布的铁棒锤A. pendulum、伏毛铁棒锤A. flavum、多裂乌头A. polyschistum为药用主流品种。目前各级药材標准均未收载多裂乌头A. polyschistum而使其沦为铁棒锤和雪上一枝蒿的伪品；药农不能出售，药厂不能购买。本研究结果表明，铁棒锤、多裂乌头、缩梗乌头主要药效成分种类基本一致，多裂乌头的双酯型乌头碱成分含量比铁棒锤高，毒性更大，但驱寒止痛、祛风定惊效果更好，不应废弃，而应另立药物名称收入标准。缩梗乌头A. sessiliflorum又名雪上一支蒿，各级药材标准也未收载，其单酯型乌头碱比铁棒锤含量高，双酯型乌头碱含量更低，安全性比铁棒锤高，可进一步研究，作口服药材使用。

参考文献：

[1] 青海省藏医药研究所，《藏医药经典文献集成》编委会.扎塘版四部医典[M].北京：民族出版社，2005：569，695.

[2] 四川省卫生厅.四川中药材标准[M].成都：四川科学技术出版社，1987：234-235.

[3] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：藏药（第一册）[M].北京：人民卫生出版社，1995：79-80.

[4] 罗达尚.中华藏本草[M].北京：民族出版社，1997：62-63.

[5] 四川省食品药品监督管理局.四川省中药材标准[M].成都：四川科学技术出版社，2010：Ⅳ.

[6] 张帆，武琳，哈木拉提·吾甫尔.民族药铁棒锤炮制前后乌头碱和3-脱氧乌头碱含量的HPLC分析[J].中成药，2011，33（3）：479-482.

[7] 王毓杰，曾陈娟，姚喆，等.铁棒锤及其炮制品中二萜生物碱化学成分研究[J].中草药，2010，41（3）：347-351.

[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：39.

[9] 万萌萌，时晓媞，谭睿.毛茛科植物铁棒锤与工布乌头的对比研究[J].中国药师，2016，19（9）：1633-1635.

[10] 王毓杰，曾陈娟，姚喆，等.民族药铁棒锤不同药用部位中生物碱含量测定[J].中成药，2010，32（8）：1390-1393.

[11] 陈树和.乌头类中药炮制历史沿革及发展概况[J].湖北中医杂志， 2017，39（11）：58-61.