半夏白术天麻汤对癫痫大鼠海马miRNA—146a—5p表达的影响及生物信息学分析

田茸 舍雅莉 董晓丽 史正刚 陈丽 程小丽 王宇

摘要：目的 通過对癫痫大鼠海马miRNA-146a-5p进行靶基因预测及信号通路生物信息学分析，为探讨癫痫的可能发病机制及半夏白术天麻汤抗癫痫作用机制的研究奠定基础。方法 采用氯化锂-匹鲁卡品诱导制作癫痫发作大鼠模型。将实验大鼠随机分为正常组、模型组、中药组，每组20只。使用miRNA芯片技术分析检测大鼠海马神经元细胞miRNA表达谱。实时荧光定量PCR检测miRNA-146a-5p表达。利用miRDB对miRNA-146a-5p进行靶基因预测，并运用miRTarBase、DAVID进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析。结果 行为学观察显示，中药组大鼠发作次数和级别均较模型组明显降低。miRNA芯片结果显示，模型组miRNA-146a-5p表达水平是正常组的2.107倍（P<0.05），经半夏白术天麻汤治疗后其表达量降至1.377倍（P<0.05）。RT-PCR结果与芯片结果一致，表达差异有统计学意义（P<0.05）。miRNA-146a-5p靶基因预测结果共有140个靶基因，GO注释共得到14个GO生物学过程注释信息（P<0.05），9个细胞组分注释信息（P<0.05），11个分子功能注释信息（P<0.05）。KEGG生物通路富集显示，其140个靶基因显著富集于EB病毒感染信号通路，以及甲状腺激素信号通路上（P<0.05）。结论 miRNA-146a-5p与癫痫发生后的炎症反应密切相关，半夏白术天麻汤可能通过控制癫痫发生后的炎症反应发挥抗癫痫的效应。

关键词：癫痫；海马；miRNA-146a-5p；半夏白术天麻汤；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.009

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）07-0034-07

Abstract： Objective To lay the foundation for studying the possible pathogenesis of epilepsy and the anti-epileptic mechanism of Banxia Baizhu Tianma Decoction through the bioinformatic analysis of target gene prediction and signal pathway of miRNA-146a-5p in hippocampus of epileptic rats. Methods Lithium-pilocarpine was used to induce seizures in rat models. The experiment rats were randomly divided into normal control group， model group， Banxia Baizhu Tianma Decoction group， with 20 rats in each group. The method of miRNA expression profiling was used to observe the miRNA differential expression of hippocampus neuron cell of rats. The expression level of miRNA-146a-5p was detected by real-time quantitative PCR. MiRDB was used for target gene prediction of miRNA-146a-5p， and miRTarBase and DAVID were used for enrichment analysis on the GO function and KEGG signaling pathway. Results The attack times and grades of the rats in Banxia Baizhu Tianma Decoction group were significantly lower than those in the model group from behavioral observation. MiRNA microarray analysis showed that the expression level of miRNA-146a-5p in model group was 2.107 times normal control group （P<0.05）， and the expression level decreased to 1.377 times after treatment with Banxia Baizhu Tianma Decoction （P<0.05）. The results

of RT-PCR was consistent with that of miRNA microarray， with statistical significance （P<0.05）. MiRNA-146a-5p target gene prediction results had 140 target genes by GO， and there were 14 annotation information of biological process （P<0.05）， 9 annotation information of cellular component （P<0.05）， 11 annotation information of molecular function （P<0.05）. Enrichment analysis of KEGG biological pathway showed that 140 target genes of miRNA-146a-5p were enriched in EB virus infection signal pathway and thyroid hormone signaling pathway （P<0.05）. Conclusion miRNA-146a-5p is closely related to the inflammatory reaction after epilepsy， and Banxia Baizhu Tianma Decoction can control epilepsy possibly by controlling the inflammatory reaction after epilepsy.

Keywords： epilepsy； hippocampus； miRNA-146a-5p； Banxia Baizhu Tianma Decoction； rats

癫痫是一种由于脑部神经元异常放电导致瞬时、反复发作的大脑功能紊乱疾病，病理机制复杂，包括神经细胞凋亡、神经胶质再生、炎症反应等，其分子机制涉及基因转录、翻译、翻译后修饰等遗传信息链中多个环节。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类在生物进化过程中具有高度保守性及稳定性的内源性非编码RNA，其主要作用是通过负性调控mRNA来协调多种靶蛋白的合成，从而影响生命进程。在神经系统中，miRNA参与神经系统疾病的生理、病理及生物反馈调节，如神经细胞发育、树突突触形成、胶质细胞增生、神经细胞凋亡及坏死等[1]。本研究运用基因芯片检测实验大鼠间的差异miRNA，选择其中的miRNA-146a-5p作为目标，通过生物信息学工具对miRNA-146a-5p靶基因的功能及其信号通路等进行多层次分析，以miRNA-146a为切入点探讨癫痫的可能发病机制，以及具有熄风化痰作用的经典方剂半夏白术天麻汤的抗癫痫作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，9周龄，体质量（200±10）g，成都达硕实验动物有限公司，动物合格证号SCXK（川）2013-24。饲养于温度18～29 ℃、相对湿度40%～70%环境，无菌条件下饲养。

1.2 药物

半夏白术天麻汤（由法半夏、天麻、茯苓、橘红、白术、甘草组成，比例为3∶2∶2∶2∶5∶1），成都中医药大学制剂室加工，按照处方比例取以上药材，用8倍量70%乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，过滤，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，醇提取浓缩液干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

氯化锂、阿托品、匹鲁卡品、水合氯醛，上海伯豪生物技术有限公司；miRNA Complete Labeling and Hyb Kit，Gene Expression Wash Buffer Kit，Agilent公司；miScript II RT Kit，美国QIAGEN；miRcute miRNA qPCR Detection Kit SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。芯片：Hybridization Chamber， stainless，Hybridization Chamber gasket slides 8 microarrays/slide， 5 slides/box，Microarray Scanner，Agilent公司。定量PCR仪，7900 HT Sequence Detection System（美国BI公司）。

1.4 分组、造模及给药

将60只大鼠随机分为正常组、模型组和中药组，每组20 只。除正常组大鼠外，其余2组均腹腔注射127 mg/kg氯化锂进行预处理，24 h后腹腔注射阿托品1 mg/kg，30 min后按35 mg/kg比例腹腔注射新配制的匹鲁卡品溶液。30 min后未引起癫痫发作的以每间隔10 min注射1次匹鲁卡品10 mg/kg，直至癫痫发作达到Ⅳ或Ⅴ级；诱发癫痫发作1 h后，腹腔注射300 mg/kg 10%水合氯醛和1 mg/kg阿托品以停止癫痫发作。正常组大鼠给予腹腔注射等剂量生理盐水。根据Racine分级[2]，大鼠癫痫发作分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级。0级：无任何反应；Ⅰ级：凝视、咀嚼和须动；Ⅱ级：点头或湿狗样抖动、搔抓；Ⅲ级：前肢局限性阵挛；Ⅳ级：伴有后肢站立的全身强直性发作；Ⅴ级：伴有站立并摔倒的全身强直-阵挛性发作。本实验以连续出现3次Ⅳ级或Ⅳ级以上的痫性发作为模型复制成功的评价标准。造模成功后1 d，中药组给予半夏白术天麻汤药液灌胃，按70 kg质量成人量换算成大鼠等效剂量，每日1次，剂量2 mL，相当于1.548 g原药材/mL，共30 d，其余2组给予等量蒸馏水同步灌胃。

1.5 标本采集

给药后第31日，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，断头取脑。于生理盐水冰面鈍性分离大鼠双侧海马组织，置于-80 ℃冰箱保存备用。整个实验过程中使用的器械均进行去酶处理。

1.6 miRNA芯片检测大鼠海马组织miRNA-146a-5p的表达

样品RNA的标记：实验样品RNA采用Agilent miRNA芯片配套的试剂盒，按照标准操作流程的标记部分对样品中的miRNA分子进行荧光标记。芯片杂交：按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒的杂交部分进行样品杂交实验。在滚动杂交炉中55 ℃，20 r/min，滚动杂交20 h。杂交完成后在洗缸中洗片，洗片所用的试剂为Gene Expression Wash Buffer Kit。芯片扫描：芯片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，软件设置Scan resolution=5 μm（大鼠），PMT 100%，用Feature Extraction software 10.7.1.1读取数据，最后采用R语言程序包AgiMicroRna进行归一化处理，所用算法为Quantile。差异基因基本信息：原始数据归一化后用Fold-change（表达差异倍数）及t检验对差异基因进行筛选。筛选条件：①Fold Change（linear）分≤阈值或Fold Change（linear）≥阈值；②t检验P<阈值。

1.7 实时荧光定量PCR验证大鼠海马组织miRNA-146a-5p的表达

组织总RNA提取与质量检测及反转录合成模板cDNA：取适量各样本组织，分别取1 μL各组织RNA 样品用核酸定量分析仪测定其OD260/OD280均在1.8～2.0，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测，提取的RNA符合纯度要求，可用于后续PCR。按反转录试剂盒要求操作，所得单链cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。 实时荧光定量PCR以U6作为内参基因，miRNA-146a-5p引物序列为：5'-TGAGAACTGAATT CCATGGGTT-3'，通过融解曲线分析，为单一峰，说明PCR扩增特异性较好，样本3次重复实验数据的重复性较好，得到各扩增反应的Ct值。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和U6的Ct值，用相对定量2-ΔΔCt法对待测miRNA进行分析。

1.8 生物信息学分析

采用miRDB对miRNA-146a-5p靶基因进行预测。并运用miRTarBase（该数据库收录了文献报道的、有实验证据的microRNA与靶基因关系）对结果进行分析。用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）在线工具进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。

1.9 统计学方法

采用Excel2015软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察结果

造模后，模型组和中药组大鼠出现节律性点头，湿狗样震颤，反复头颈上仰，前肢交叉伴前冲动作，全身强直抖动，伴发声音，继而出现反复前肢阵挛、伴站立、跌倒、翻转，进入癫痫持续状态。3～14 d，大鼠出现精神萎靡、进食活动减少、消瘦，精神紧张、怕人、畏惧声响，冲撞笼栏，甚至咬人等易激惹状态。15～30 d，模型组大鼠出现癫痫自发发作，发作级数在Ⅰ～Ⅴ级之间不等，自发发作后大鼠高度紧张、兴奋、易激惹，甚至躁狂。发作频繁时，模型组大鼠进食明显减少，毛发发黄、无光泽。中药组大鼠发作次数和级别均较模型组大鼠明显降低，进食、体质量、毛发等一般情况也较模型组大鼠良好。正常组大鼠一切表现均正常。

2.2 大鼠海马组织miRNA-146a-5p的差异表达

利用miRNA 芯片技术分析正常组、模型组和中药组的miRNA表达谱，在检测的758种miRNA中，模型组较正常组共有49种miRNA产生差异表达，其中造模后26种miRNA显著上调，23种显著下调，差异均有统计学意义（P<0.05）；中药组较模型组共有38种miRNA产生差异表达，其中32种miRNA显著上调，6种显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组miRNA-146a-5p的表达较正常组明显上调，其差异表达倍数是2.030；中药组较模型组明显下调，其差异表达倍数是0.590，差异有统计学意义（P<0.05）；中药组与正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 大鼠海马组织miRNA-146a-5p的表达情况

模型组大鼠海马组织miRNA-146a-5p表达明显升高（P<0.05），且表达量是正常组的2.107倍；经半夏白术天麻汤治疗后中药组大鼠海马组织miRNA-146a-5p表达明显降低（P<0.05），其表达量降至1.377倍。RT-PCR验证结果与miRNA芯片分析结果趋势一致。

2.4 miRNA-146a-5p靶基因预测结果

用miRDB对miRNA-146a-5p靶基因的进行预测，结果发现预测的靶基因共有140个，其中预测评分在80分以上共37个靶基因，见表1。并运用miRTarBase数据库对结果进行分析，发现主要集中在6个靶基因上，见表2。

2.5 miRNA-146a-5p靶基因GO分析结果

针对以上miRNA-146a-5p的140个预测靶基因，通过GO注释描述共得到14个GO生物学过程（biological process，BP）注释信息（见表3）、9个细胞组分（cellular component，CC）注释信息（见表4）及11个分子功能（molecular function，MF）注释信息（见表5）。BP注释信息主要集中在聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、蛋白质定位的建立、负转录调控DNA模板、细胞间连接组织、心脏发育、基因表达负调控、剪接调控、酮体分解、核转录mRNA降解过程中核酸外切、血管平滑肌細胞的发育、细胞反应的UV-C、肌性间隔形态、细胞黏附、大脑发育等；CC注释信息主要集中在核仁、细胞核、细胞膜、细胞质、核质、核斑点、蛋白复合物、突触、染色质；MF注释信息主要集中在聚（A）RNA结合、蛋白复合物的结合、蛋白结合、蛋白体的活动、蛋白激酶活性、Toll样受体结合、组蛋白去乙酰化酶结合、泛素蛋白连接酶的活性、PDZ结构域结合、相同蛋白结合、钙黏蛋白结合参与细胞与细胞间的黏附。

2.6 KEGG通路分析结果

在GO注释分类的基础上，利用已有生物通路数据，对基因集合中的140个基因进行生物通路富集分析。结果显示，在经典通路数据库KEGG中miRNA-146a-5p显著富集于EB病毒感染信号通路，以及甲状腺激素信号通路上，差异有统计学意义（P<0.05）。见表6。

3 讨论

癫痫的发生与神经细胞的凋亡、突触联系重建、神经胶质纤维细胞增生、异常通路形成及炎症反应密切相关[3-4]。反复的癫痫发作可导致大脑海马神经元凋亡，形成异常兴奋性突触环路，最终促进难治性颞叶癫痫形成。研究表明，脑内的炎症过程是癫痫发作的一个重要机制，即癫痫发生后启动一系列炎症反应，导致炎症递质大量释放。一方面炎症递质可引起血管炎，破坏血脑屏障，加重脑水肿及神经损害；另一方面，炎症递质可调节兴奋性氨基酸的释放和影响离子通道结构和表达，从而增高神经元细胞兴奋性，进一步促进癫痫发作。所以，炎症反应对于癫痫发作的持续存在起着重要作用[5]。

有研究表明，miRNA-146a通过转录后水平调控核因子-κB（NF-κB）、白细胞介素（IL）-1等表达，影响癫痫发作后炎症反应，提高癫痫脑组织miRNA-146a的水平可以减轻炎症反应，从而治疗癫痫[6]。Omran A等[7]研究发现，在幼年大鼠颞叶内侧癫痫模型中，不同时期大鼠海马IL-1与miRNA-146a的水平成反比，提示miRNA-146a在炎症反应中起负性调控作用，即在癫痫过程中起着“抗炎”作用。但也有研究表明，轻型脑创伤后皮质区miRNA-146a表达显著上调，NF-κB通过miRNA-146a上游调控元件增强miRNA-146a的转录水平，NF-κB-miRNA-146a途径可能在促进脑创伤后炎症反应过程中发挥重要作用[8]。本研究通过基因芯片和实时荧光定量PCR检测出模型组大鼠miRNA-146a-5p表達显著上调，经具有熄风化痰作用的半夏白术天麻汤治疗后miRNA-146a-5p的表达水平显著下调。

通过miRNA-146a-5p预测靶基因并针对靶基因进行GO及KEGG通路分析，GO生物学过程主要集中在对RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、DNA模板转录、基因表达的负调控、剪接调控、核转录mRNA降解过程中核酸外切，以及参与心脏发育和大脑发育；GO细胞组分主要集中在核仁、细胞核、核质、突触、染色质等；GO分子功能主要集中蛋白结合、蛋白体活动、蛋白激酶活性、Toll样受体结合、细胞间黏附等。

KEGG通路分析miRNA-146a-5p显著富集于EB病毒感染信号通路，其中涉及的关键基因有MDM2原癌基因（Mdm2）、肿瘤坏死因子受体相关因子6 （Traf6）、槐定碱（SP）、IL-1受体相关激酶1（Irak1）和脾相关酪氨酸激酶（Syk）等，大量研究集中在Mdm2与p53相关性上，有研究表明SCYL1BP1是存在于轴突生长物中的一种新的转录激活因子，通过直接调控MDM2/p53依赖途径，可能在中枢神经系统发育和损伤后轴突再生中发挥重要作用[9]。研究表明p62通过影响TRAF6泛素化调节神经生长因子诱导的NF-κB活化[10]。SP可能是通过下调TRAF6的表达和上调ERK1/2磷酸化的表达发挥神经保护作用[11]。慢性的IL-18水平升高可能是通过增加Irak1的水平和NF-κB的活性加重胰岛素抵抗，增强血管炎症和重塑的[12]。Syk通过血管平滑肌细胞增殖和表型调制对血管重塑起着重要的作用，通过连接免疫受体到下游效应分子出现在小脑、海马、视觉和嗅觉系统神经元的不同结构[13]。

综上，miRNA-146a-5p与癫痫发生后的炎症反应密切相关，但具体发生机制还有待进一步研究，而半夏白术天麻汤则有可能通过控制癫痫发生后的炎症反应起到抗癫痫的效果。本研究为下一步深入研究癫痫发病机制和半夏白术天麻汤的治疗机制提供了切入点。

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