切片与切段对叠鞘石斛多糖、联苄类化合物及石斛酚提取量的影响研究

2018-10-19谢巧栗圣榕廖莉颜成功张廷模夏厚林

中国药房 2018年17期

谢巧栗圣榕廖莉颜成功张廷模夏厚林

中图分类号 R284.2；R282.4 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）17-2376-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.17

摘要目的：研究切片、切段对叠鞘石斛中多糖、联苄类化合物及石斛酚提取量的影响，比较叠鞘石斛切片、切段的优劣。方法：将叠鞘石斛燀蒸后切制成长度为10 mm的段及厚度为4 mm的片，于60 ℃烘干，然后将叠鞘石斛片（段）煎煮60、90、120 min及温浸60、90 min；采用紫外-可见分光光度法测定其在煎煮及温浸过程中多糖、联苄类化合物提取量，采用高效液相色谱法测定叠鞘石斛片（段）中石斛酚的提取量；另计算浸出物提取率。结果：在煎煮过程中，叠鞘石斛片较石斛段多糖、联苄类化合物提取量分别增加了0.06～0.17、0.08～0.11 mg/g，石斛酚提取率增高了37.5%；在温浸过程中，叠鞘石斛片较石斛段多糖、联苄类化合物提取量分别增加了0.33～0.58、0.17～0.28 mg/g；疊鞘石斛片较石斛段的水溶性浸出物及醇溶性浸出物提取率分别增高了2.89%、0.98%。结论：叠鞘石斛切片优于切段，本研究可为《中国药典》中石斛切制时改段为片提供一定的参考。

关键词叠鞘石斛；切片；切段；多糖；联苄类化合物；石斛酚

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of slice and segment on the extraction amount of polysaccharides， bibenzyl compounds and dendrophenol from Dendrobium denneanum， and to compare the advantages and disadvantages of D. denneanum slice and segment. METHODS： The steamed D. denneanum was cut into segment with length of 10 mm and slice with thickness of 4 mm， and then dried at 60 ℃. Then D. denneanum slice （segment） decocte 60， 90， 120 min and warm-soak 60， 90 min， UV spectrophotometry was used to determine the extraction amount of polysaccharides and bibenzyl compounds from it. HPLC method was used to determine the extraction amount of dendrophenol from D. denneanum slice （segment）， and calculate the extraction rate of it separately. RESULTS： Compared with D. denneanum segment， the extraction amount of polysaccharides and bibenzyl compounds in D. denneanum slice were increased by 0.06-0.17 mg/g and 0.08-0.11 mg/g during decocting， and the extraction rate of dendrophenol was increased by 37.5%. During the warm-soaking process， compared with D. denneanum segment， extraction amount of polysaccharides and bibenzyl compounds in D. denneanum slice were increased by 0.33-0.58 mg/g and 0.17-0.28 mg/g， respectively. Compared with D. denneanum segment the extraction rates of water-soluble extracts and alcohol-soluble extracts in D. denneanum slice were increased by 2.89% and 0.98%， respectively. CONCLUSIONS： D. denneanum slice is superior to D. denneanum segment， which provides reference for changing segment into slice about the cutting of D. denneanum in Chinese Pharmacopeia.

KEYWORDS Dendrobium denneanum； Slice； Segment； Polysaccharides； Bibenzyl compounds； Dendrophenol

石斛是一种名贵中药材，始载于《神农本草经》，被列为上品，具有益胃生津、滋阴清热的功效。现代研究表明，石斛具有抗氧化[1-3]、增强机体免疫力[4]、抗肿瘤[5]等活性。石斛常用品种有金钗石斛、鼓槌石斛以及流苏石斛及其近似品种[收载于2015年版《中国药典》（一部）[6]]、环草石斛、黄草石斛和马鞭石斛（收载于《安徽省中药饮片炮制规范》2005年版[7]）、叠鞘石斛（收载于《四川省中药材标准》2010年版[8]）等。叠鞘石斛[Dendrobium aurantiacum Rchb.var.denneanum （Kerr.） Z.H.Tsi.]是兰科植物叠鞘石斛栽培品的新鲜或干燥茎[8]，为石斛的近似种，是四川省著名道地药材“嘉定石斛”的主要品种[9]，具有地方特色，在四川省乐山市夹江县已广为栽培并供药用，且在广东、广西、贵州等地常作为石斛药材临床使用[10]，在全国资源量较大，选择叠鞘石斛进行研究具有一定的代表性。

由于加工器械的限制，过去石斛的切制主要采用切段，故《中国药典》1953-2015年版中石斛皆切制为段。文献研究表明[11-12]，石斛在地方标准中还可切片使用，如《浙江省中药炮制规范》2005年版对石斛除切段外还可切厚片（2～4 mm）等。本课题组前期试验发现，石斛切段虽简便，但在煎煮浸泡时有不易过芯、易漂浮在水面、有效成分煎出率低（石斛酚煎出率仅为0.015%～0.067%）等缺点，可见，《中国药典》中对石斛进行切段处理可对石斛这一贵重药材造成一定的浪费。因此，从完善石斛切制方法、提高药材利用率的角度出发，本研究选择叠鞘石斛为研究对象，以叠鞘石斛中有效成分多糖、联苄类化合物的总量及联苄类单体石斛酚为指标比较叠鞘石斛切片切段的优劣，为《中国药典》中石斛切制改段为片提供参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-2600紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；BS-124S电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；SB-5200DTD 超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（北京医疗设备厂）；L-550台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

叠鞘石斛药材（批号：D20161018w2，于2016年10月购于四川万安石斛产业开发有限公司，经成都中医药大学药用植物教研室卢先明教授鉴定为兰科石斛属植物叠鞘石斛。将采集的新鲜叠鞘石斛洗净后于沸水中燀2 min，去除叶片，切制成长度为10 mm的段及厚度为4 mm的片，并于60 ℃烘干，备用[12]。按《四川省中药材标准》2010年版叠鞘石斛项下方法检验，各项指标均合格[8]）；葡萄糖对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：P-012-150730，纯度：>98%）；石斛酚对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq16081604，纯度：>95%）；福林酚（批号：2016062201）、无水碳酸钠（批号：2016041601，分析纯）、干酪素（批号：2015050801，化学纯）均购自成都市科龙化工试剂厂；硫酸（四川西陇化工有限公司，批号：170303，分析纯）；苯酚（成都市科龙化工试剂厂，批号：2015091501，分析纯）；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 叠鞘石斛片、段吸水率的测定

采用自然过滤法[13]。称取叠鞘石斛片、段各5 g，记录药材饮片原始质量（m），分别浸泡30、40、50、60 min时滤出药材，过筛，称质量，得出吸水后的药材质量（mi），并根据公式[吸水率（%）=（mi-m）/m×100%]计算吸水率。叠鞘石斛片、段吸水率测定结果详见表1。

由表1可知，浸泡相同时间，叠鞘石斛片、段吸水率差异较大，相比于叠鞘石斛段，叠鞘石斛片更易浸泡过芯。

2.2 温浸液和煎煮液的制备

2.2.1 温浸液的制备参照铁皮石斛枫斗日常服用方式进行试验[14]。称取叠鞘石斛片、段各3 g（各2份），分别置于250 mL圆底烧瓶中，加入80 ℃热水200 mL，密塞，于80 ℃水浴条件下分别保温浸泡60、90 min后过滤，即得。

2.2.2 煎煮液的制备参照中药饮片标准汤剂进行试验[15]。称取叠鞘石斛片、段各5 g（各3份），分别置于250 mL圆底烧瓶中，加入50 mL水浸泡60 min，然后分别回流煎煮60、90、120 min后过滤，并将各续滤液定容至50 mL，即得。

2.3 多糖提取量的测定

参照本课题组前期建立的叠鞘石斛多糖含量测定方法[16]进行试验。

2.3.1 对照品溶液的制备精密称定葡萄糖对照品6.98 mg，置于10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，得贮备液；再精密吸取1 mL贮备液，加水定容至5 mL，得质量浓度为139.6 ?g/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备精密量取“2.2”项下温浸液2 mL（煎煮液0.5 mL，加水补至2 mL），加入10 mL无水乙醇，摇匀，4 ℃冷藏60 min后4 000 r/min离心20 min（离心半径9.6 cm），弃去上清液，沉淀加8 mL 80%乙醇洗涤2次后加热水溶解，放冷，再转移至5 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 标准曲线的绘制精密量取“2.3.1”项下对照品溶液0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，分别加水补至1 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL（临用配制），摇匀，再精密加入硫酸5 mL，摇匀，置于沸水浴中加熱20 min，取出，置于冰浴中冷却5 min，以相应试剂为空白对照，于紫外-可见分光光度计488 nm波长处测定吸光度值。以对照品质量浓度为横坐标（x）、吸光度值为纵坐标（y）绘制标准曲线，得回归方程y=0.009 9x-0.062 5（R2=0.999 7）。结果表明，多糖检测质量浓度线性范围为6.86～112.15 ?g/mL。

2.3.4 提取量的测定精密量取“2.3.2”项下供试品溶液1 mL，按“2.3.3”项下方法分别测定叠鞘石斛片、段经煎煮和温浸两种过程的多糖提取量，平行测定3次。对比分析叠鞘石斛片、段经煎煮和温浸两种过程多糖的提取量，结果详见图1。

由图1可知，煎煮过程叠鞘石斛片的多糖提取量高出叠鞘石斛段0.06～0.17 mg/g，温浸过程叠鞘石斛片的多糖提取量高出叠鞘石斛段0.33～0.58 mg/g；可见，经温浸和煎煮后叠鞘石斛片的多糖提取量皆优于叠鞘石斛段。

2.4 联苄类化合物提取量的测定

参照本课题组建立的叠鞘石斛联苄类化合物总量测定方法[17-18]进行试验。

2.4.1 对照品溶液的制备精密称定石斛酚对照品5.02 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，得质量浓度为1.004 mg/mL的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备精密量取“2.2”项下温浸液（煎煮液）3 mL，加入0.01 g干酪素，再置于30 ℃水浴中保温1 h（随时振摇），取出，放冷，滤过；取续滤液400 ?L，加水补至1 mL，即得。

2.4.3 标准曲线的绘制取1.004 mg/mL石斛酚对照品溶液0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mL，分别置于10 mL具塞试管中，各加水补至1 mL；精密加入1 mL福林酚试剂，摇匀，加入5 mL 10% Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，于30 ℃水浴中反应60 min，取出；以相应试剂为空白对照，于紫外-可见分光光度计760 nm波长处测定吸光度值。以对照品质量浓度为横坐标（x）、吸光度值为纵坐标（y）绘制标准曲线，得回归方程y=0.013x- 0.019 7（R2=0.999 7）。结果表明，联苄类化合物检测质量浓度线性范围为10.74～90.53 ?g/mL。

2.4.4 提取量的测定精密量取“2.4.2”项下供试品溶液1 mL，按“2.4.3”项下方法测定叠鞘石斛片、段经煎煮和温浸后联苄类化合物提取量，平行测定3次。对比分析叠鞘石斛片、段经煎煮和温浸后联苄类化合物的提取量，结果详见图2。

由图2可知，煎煮后叠鞘石斛片中的联苄类化合物提取量高出石斛段0.08～0.11 mg/g，温浸后叠鞘石斛片中联苄类化合物的提取量高出叠鞘石斛段0.17～0.28 mg/g；可见，经煎煮和温浸后叠鞘石斛片的联苄类化合物提取量皆优于叠鞘石斛段。

2.5 石斛酚的含量测定

参照本课题组建立的石斛酚含量测定方法[19]进行试验。

2.5.1 色谱条件色谱柱：InertSustain-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-水-甲酸（35 ∶ 65 ∶ 0.1，V/V/V）；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 ?L。

2.5.2 供试品溶液的制备取叠鞘石斛片、段各5 g，分别置于250 mL圆底烧瓶中，加50 mL水，浸泡60 min，回流煎煮2 h，滤过；取续滤液蒸干，甲醇溶解残渣后，转移至2 mL量瓶中定容，摇匀，过滤，即得。

2.5.3 标准曲线的绘制称取石斛酚对照品5.01 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，再稀释成质量浓度为1、2、5、10、100、200、500 ?g/mL的对照品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得回归方程y=17.605x-0.42（R2=0.999 9）。结果表明，石斛酚检测质量浓度线性范围为1.02～499.40 ?g/mL。

2.5.4 石斛酚提取量的测定取“2.5.2”项下供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件，测定叠鞘石斛片、段中石斛酚提取量并进行分析，平行测定3次，结果详见表2。

由表2可知，煎煮后叠鞘石斛片中的石斛酚提取量高于叠鞘石斛段。

2.6 浸出物提取率的测定

参照2015年版《中国药典》（四部）中“浸出物测定法”项下方法[20]测定叠鞘石斛片、段中水溶性浸出物和醇溶性浸出物提取率，平行测定3次。两种浸出物提取率结果见表3。

由表3可知，叠鞘石斛片水溶性浸出物和醇溶性浸出物提取率均高于叠鞘石斛段。

3 讨论

叠鞘石斛药材的茎呈细长圆柱形，长20～63 cm，直径0.3～1.2 cm，2015年版《中国药典》（一部）收载的金钗石斛直径0.4～0.6 cm，鼓槌石斛中部直径1～3 cm，流苏石斛直径0.4～1.2 cm，可见叠鞘石斛茎的直径范围较宽，选择叠鞘石斛作切片、切段对比研究具有一定的代表性。

王再花等[21]检测叠鞘石斛、杯鞘石斛、齿瓣石斛、重唇石斛、钩状石斛、铁皮石斛、细茎石斛、金钗石斛、报春石斛等35种品种，发现石斛中生物碱含量较低，大约为0～0.638%。多糖类成分是石斛属植物含量最高的成分，是其增强免疫力、降低血糖以及抗肿瘤的物质基础[5]。石媛慧[22]在叠鞘石斛与肿节石斛、反瓣石斛、翅萼石斛、翅梗石斛的对比研究中发现其多糖含量范围为2.06%～8.73%，其中叠鞘石斛多糖含量高达5.81%。联苄类化合物是石斛抗肿瘤作用的主要活性成分，也是铁皮石斛、鼓槌石斛等具有抗肿瘤活性的有效成分之一[5]，含有联苄类化合物的石斛品种有束花石斛、鼓槌石斛、叠鞘石斛、流蘇石斛等。贾芳等[16-17]研究发现，采用紫外分光光度法测定叠鞘石斛中联苄类化合物含量稳定性较好，其含量范围为0.47%～0.67%。叠鞘石斛联苄类化合物主要有石斛酚、杓唇石斛素和鼓槌联苄等，石斛酚为其特征性成分[23]，一般将石斛酚作为联苄类的指标性化合物进行定性或定量研究[24]。因此，本研究选择多糖、联苄类化合物以及石斛酚的提取量为指标进行叠鞘石斛切片、切段的比较研究。本课题组前期研究发现，叠鞘石斛中石斛酚煎出率较低，仅为0.015%～0.067%，在煎煮过程及温浸过程中检测到的石斛酚响应信号较弱，较难进行分步测算，故本试验中选择回流煎煮2 h测定石斛酚单体的提取总量。

本研究也对煎煮过程和温浸过程中多糖、联苄类化合物的提取量进行考察。传统中药多煎煮服用，因此本试验重点考察煎煮过程。考察煎煮后多糖、联苄类化合物、石斛酚的提取量以及浸出物的提取率。补充温浸试验，主要是体现石斛日常茶饮习惯，参照文献选择了60、90 min这2个时间点进行考察[13]，温浸过程溶出的多糖、联苄类化合物总量高于煎煮过程，其原因是温浸过程加水量大，使得有效成分溶出量相对较多。

叠鞘石斛片经煎煮后多糖、联苄类化合物以及石斛酚的提取量均高于叠鞘石斛段，经温浸后多糖、联苄类化合物提取量优于叠鞘石斛段，其原因是由于叠鞘石斛片较易浸泡过芯。浸出物可以表征去除水溶性多糖和其他醇不溶性成分后的其他物质含量，本试验也得出叠鞘石斛片的水溶性浸出物及醇溶性浸出物的提取率均高于叠鞘石斛段。

综合分析试验结果可知，叠鞘石斛切片优于切段，本试验结果为《中国药典》石斛药材切制改段为片提供了一定的参考价值。

参考文献

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