DNA-微阵列芯片法检验结核与非结核分枝杆菌的临床应用价值

徐微

吉林省结核病医院检验科，吉林长春 130500

非结核分枝杆菌是指结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌与牛分枝杆菌以外的分枝杆菌，其特征与结核分枝杆菌有明显差异，现已备受各界学者的关注[1]。目前，临床主要通过抗酸染色法、罗氏法等进行结核与非结核分枝杆菌诊断，然而抗酸染色法鉴别效果较差，罗氏法虽然准确率较高，但检验时间长、操作复杂，无法为患者早期诊疗工作提供保障[2]。因此，探寻一种快速、准确的检验方法鉴别各类型分支杆菌十分必要。该研究随机选择2016年12月—2018年3月该院痰结核培养或结核分枝杆菌痰涂片阳性标本108份，采用博奥生物有限公司生产的DNA-微阵列芯片法进行检验，并与改良罗氏法与测序法对比，探讨DNA-微阵列芯片法对结核与非结核分枝杆菌的鉴别价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择该院痰结核培养或结核分枝杆菌痰涂片阳性标本108份，其中痰培养阳性48份，痰涂片阳性60份。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂 主要仪器：E-Cycler96梯度PRC仪，BioMixerII芯片杂交仪，Extractor36核酸快速提取仪，Luxscan10K-B微阵列芯片扫描仪。试剂：噻吩-2-羧酸肼、对硝基苯甲酸与改良罗氏培养基均由天津金章科技发展有限公司提供，DNA-微阵列芯片分枝杆菌菌种鉴定试剂盒由北京博奥生物有限公司提供。

1.2.2 检验方法 108份标本均采用改良罗氏培养法、DNA-微阵列芯片法检验，对二者检验结果不一致的标本进行测序，并将结果作为检验的金标准。⑴改良罗氏培养法：通过对硝基苯甲酸生长实验初步鉴定菌种，识别出的结核分枝杆菌菌株，并以绝对浓度法给予分枝杆菌药物敏感检验。试验方法根据中国防痨协会制定的 《结核病诊断实验室检验规程》执行。⑵DNA-微阵列芯片法检验：根据试剂说明书中的标准进行相关操作。①核酸提取：选取核酸提取液80 μL并置于提取管中，加入无菌接种环挑取的涂片阳性痰液或培养阳性菌落。通过核酸快速提取仪进行震荡，时间为5 min，再以90℃水浴 5 min，速度5 000 rpm离心1 min，取出核酸放置在-20℃的冰箱内待检。②PCR扩增：在每个样品上设置3个复孔，并实施扩增反应。在200 μL离心管内加入PCR扩增试剂1～3各18 μL，并在3个离心管内加入包含待检样品DNA的核酸提取管内上清液2 μL，放置在PCR扩增仪中，根据说明书内的热循环流程给予PCR扩增。PCR引物序列均由博奥生物有限公司提供，其中PCR扩增试剂1～3扩增分别为分枝杆菌属探针序列，rpoB基因突变位点序列，inhA与katG基因突变位点序列。③芯片杂交：加热杂交缓冲液，温度控制在50℃，待其完全融化合混匀后，分别取9 μL放置在2管内。各取3 μL PCR1与2产物加入上述2个杂交缓冲液管内，配制成混合物R。各取3 μL PCR1与3产物配制混合物H。加热杂交混合物，温度为95℃，使其变性5 min，之后冰浴3 min。在加样孔内加入13.5 μL混合物，微阵列1加入混合物R，微阵列2加入H，密封放置在温水（50℃）浴锅内120 min。④洗涤与干燥：拆开杂交盒，取出芯片放置在包含芯片洗涤液Ⅰ的容器内，以80～100 rpm的速度恒温振荡，洗涤3 min。之后以80～100 rpm的速度恒温振荡芯片洗涤液Ⅱ，洗涤3 min。最后将芯片放置在离心机内，以800 rpm的速度离心5 min，甩干后扫描。⑤扫描与结果读取：通过微阵列芯片扫描仪与相关软件读取信号与结果。⑶测序：将改良罗氏培养与DNA-微阵列芯片法检验不一致的标本进行DNA序列检验，利用博奥生物有限公司生产试剂盒中的引物作为测序上下游引物。

1.3 观察指标

将测序结果作为金标准，评价改良罗氏法、DNA-微阵列芯片法对结核与非结核分枝杆菌的鉴别效果。改良罗氏培养法鉴别标准：选取罗氏培养基上单个菌落实施噻吩-2-羧酸肼与对硝基苯甲酸检验，当噻吩-2-羧酸肼（+），对硝基苯甲酸（-）时为结核分枝杆菌；当噻吩-2-羧酸肼（+），对硝基苯甲酸（+）时为非结核分枝杆菌。DNA-微阵列芯片法鉴别标准：按照芯片上探针在特定位置的排布，读取受检细胞的信息，继而鉴定出分枝杆菌菌种。

1.4 统计方法

该研究数据采用SPSS 15.0统计学软件分析，计数资料采用[n（%）]表示，以 χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

108份标本经测序结果显示，结核分枝杆菌26份，非结核分枝杆菌82份。经改良罗氏培养法检验，鉴定为结核分枝杆菌25份，非结核分枝杆菌80份；经DNA-微阵列芯片法检验，鉴定为结核分枝杆菌24份，非结核分枝杆菌79份，其中包括戈登分枝杆菌16份，胞内分枝杆菌30份，堪萨斯分枝杆菌10份，偶然分枝杆菌5份，复合群鸟分枝杆菌10份，无法读取8份。经改良罗氏培养法检验对结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的准确率为96.15%、97.56%，与DNA-微阵列芯片92.31%、96.34%对比差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表 1。

表1 改良罗氏法、DNA-微阵列芯片法对结核与非结核分枝杆菌的鉴别效果对比[n（%）]

3 讨论

分枝杆菌属于细菌的一大类，其包含不同的细菌菌种，结核分枝杆菌可导致人类罹患结核病，非结核分枝杆菌则是分枝杆菌类目下的细菌，不是导致结核病的原因[3]。近年来，非结核分枝杆菌的感染率显著攀升，且感染种类也不断增加，现已备受临床学者的关注[4]。由于致病性非结核分枝杆菌感染与结核病症状相似，均存在全身症状与局部损害，且二者影像学表现十分相近，极易发生误诊，延误治疗时机[5]。

目前，改良罗氏法是鉴别结核与非结核分枝杆菌的主要检验方法，可以直观观察到细菌的生长。然而，部分研究发现，改良罗氏法易受菌龄、菌量与受检者主观因素的影响，加之检验周期长（通常从患者就诊到获取到敏感结果需要2～3个月）、操作复杂，无法为患者提供早期诊断依据[6-7]。目前，分子生物学技术是热门的快速检验方法。DNA-微阵列芯片法与线性探针相似，其技术特点是通过设计PCR扩增引物与寡核苷酸探针，在芯片表现上固定，并经与针对性扩增受检样本的DNA片段杂交，利用芯片扫描仪对杂交后的芯片荧光信号进行扫描，继而读取出菌种信息[8]。同时，DNA-微阵列芯片可在6 h得出检验结果，操作简单、快速，并能够同时鉴别17种分枝杆菌，有效保证了患者的治疗时机。学者何建[9]对125例结核分枝杆菌痰涂片阳性标本与传统培养结核分枝杆菌阳性标本，应用了DNA微阵列芯片法检测耐药性，结果发现该方法对异烟肼耐药的一致率为98.8%，对利福平的一致率为99.4%，并认为DNA微阵列芯片检测结核分枝杆菌的耐药性效果可靠，且用时短，可用于临床筛查。学者何莉等[10]对64例改良罗氏法阳性分枝杆菌核酸应用了DNA-微阵列芯片法检测，并以测序法作为金标准，结果显示两种方法检测的一致率为93.8%，非结核分枝杆菌一致率95.8%，结核分枝杆菌一致率87.5%。该文研究结果与上述结果相符，改良罗氏培养法对结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌检验的准确率为96.15%、97.56%，与DNA-微阵列芯片92.31%、96.34%对比差异无统计学意义（P＞0.05）。 可见，DNA-微阵列芯片与改良罗氏法鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的效果相当，但DNA-微阵列芯片的检验速度更快，为临床诊疗提供了有利的参考。108份标本中，DNA-微阵列芯片菌种显示无法读取5份，其中4份样本在偶然分枝杆菌荧光探针处肉眼观察到微弱的荧光信号，但因背景过亮，干扰了信号值的读取；1份样本不仅背景过亮，且荧光存在杂质，导致荧光信号极弱。究其原因可以与以下几项有关：①开始加样-干燥芯片的某个环节中，芯片微阵列液体直接暴露在空气中过久，样本过于干燥而提高了芯片背景亮度；②实验样本受到污染，导致芯片背景存在杂质；③核酸浓度差异对结果读取造成了干扰[10]。

综上所述，DNA-微阵列芯片法在结核与非结核分枝杆菌检验中具有较高的准确率，且操作简单、快速，临床应用价值显著，适于推广。