经颅磁声耦合电刺激技术应用于小鼠的实验研究*

刘世坤，张鑫山，周晓青，殷涛，刘志朋

(中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津 300192))

1 引 言

在脑科学及神经科学的研究中，各类物理刺激(如电刺激、磁刺激、光刺激和超声刺激等)正发挥着愈加重要的作用，现已被广泛应用于脑功能认知及脑部神经功能性疾病的研究和治疗。其中，经颅神经电刺激有着巨大优势。早在1874年，美国的Bartholow在脑手术中用电极直接电刺激大脑运动区引起对侧肢体抽动[1]，揭开了神经电刺激用于神经调控的序幕。到今天，通过科学家们对神经电刺激的探究，神经电刺激已经引起了广泛的关注，并逐步成为科学研究和临床诊疗的重要手段。非侵入的经颅神经电刺激不仅用于诊断和治疗脑神经疾病，同时也可以调控大脑功能，为探索大脑认知过程的机制，提供了新的支撑技术。

本研究探讨的经颅磁声耦合电刺激(transcranial magneto-acoustic stimulation, TMAS)属于新型的无创脑神经电刺激技术，即在神经组织或组织液中利用静磁场和超声波通过霍尔效应来产生电流去无损伤地刺激神经组织。2003年Norton最先提出借助超声聚焦性和传播深度的优势，将该原理应用于电刺激，并对磁声耦合电刺激进行了理论推导，计算结果表明该方法可以产生感应电流，并应用于刺激目标神经[2]。与经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation, TMS)和经颅直流电刺激(transcranial direct current stimulation, tDCS)相比，TMAS具有更高的空间分辨率，因为TMAS的空间分辨率是由聚焦超声斑的直径大小决定，而超声声斑较磁场聚焦区域小。

在此之前，Li曾对TMAS的刺激原理进行了仿真和验证性实验[3]，验证了该方法的可行性。为进一步探究TMAS应用于动物神经刺激的效果，本研究搭建了TMAS实验系统，设计了针对小鼠的刺激参数，开展健康鼠和帕金森(parkinson’s disease，PD)模型鼠的在体实验。

2 方法

2.1 TMAS技术的原理

经颅磁声刺激的物理原理是神经组织中的离子在超声波的作用下发生振动,因为静磁场与带电离子的运动方向垂直，所以在组织中的带电离子在与静磁场和振动方向均正交的方向产生洛伦兹力，产生的洛伦兹力将正负离子带往相反的方向，从而在组织内形成刺激电场[4]。

图1 原理图

原理图见图1，在磁场B0的作用下，当超声波带动导电组织产生相同振动速度V的运动时，可导电组织中产生的电场E为：

E=VB0

(1)

且组织中粒子振动的速度V与超声声压P之间关系为：

P=ρCsV

(2)

ρ为组织密度，Cs为组织中超声传播速度。

将式(2)带入式(1)得到电场分布情况：

(3)

由于电流密度J=σE，所以组织内部电流密度为：

(4)

由式(4)可看出，由于神经组织中ρ与Cs不变，磁声耦合刺激产生的电场与电流密度仅与磁场强度和声压有关，且该电场方向为静磁场与声束振动方向的矢量积方向；即在静磁场大小不变时，电流大小与超声声压成线性关系。

2.2 小动物TMAS系统

为了进行在体小动物的磁声耦合刺激实验，搭建了一套针对小动物的在体TMAS实验平台，包括超声激励发生装置、静磁铁、超声换能器及小动物固定装置、呼吸麻醉装置等，见图2。

图2系统示意图

Fig2Systemdiagram

图2中设备分别为①脑立体定位仪，②超声换能器，③超声准直器，④静磁铁，⑤函数发生器，⑥门控放大器，⑦呼吸麻醉系统。

在TMAS实验中，首先在函数信号发生器(AFG3252，Tektronix，美国)设定实验需要的超声信号，经由高能门控放大器(GA-2500A，RITEC，美国)放大，将脉冲信号伏值提至1 000 V形成超声激励信号，驱动定制聚焦型超声换能器(主频1 MHz，焦距2.35 cm，焦点直径2 mm，中科院声学所制)产生竖直方向的超声声束，声束通过超声准直器(注满超声耦合剂的锥形筒，减少超声在空气中传播产生的衰减)到达小鼠头皮进行刺激。实验用鼠固定在电磁兼容型脑立体定位仪上，并在实验过程中使用呼吸麻醉系统(R520IP，瑞沃德，中国深圳)保持麻醉，同时在鼠头部一侧放置静磁铁提供水平方向的稳恒磁场。

2.3 参数选择与真实颅内声压检测

综合考虑磁声耦合电场强度及超声安全，本实验中所使用的超声刺激信号为主频1 MHz，脉冲宽度200 μs，重复频率1 Hz的超声波脉冲，每次刺激时间持续2 min，共120个脉冲，波形见图3。

系统中静磁场强度为0.3 T，由高斯计(475DSP，Lakeshore，美国)测试获得。

图3 超声信号与参数

为了获得本TMAS系统以及所使用参数在小动物颅内所产生的真实声压，将一只C57BL/6J小鼠麻醉后颈椎脱臼处死，头部固定于实验系统中，头顶脱毛，涂抹超声耦合剂，并将换能器置于其头部形成刺激点，在最大限度不影响颅内密闭性的前提下，将针式水听器(1 MHz下灵敏度2.71 uV/Pa，中科院声学所制)穿过小鼠的下颚，深入颅内，并将调整针式水听器方向，使其与超声换能器声束在同一直线。之后开启超声刺激设备，在示波器中同步检测超声发射信号与水听器检测信号，从而得出在超声脉冲发射时，小鼠颅内的真实声压，测得在本实验系统下，上述参数可以在小鼠颅内产生约3.1 MPa的瞬时声压。

2.4 在体小动物的TMAS实验

2.4.1健康小鼠的TMAS实验 首先使用健康小鼠进行了TMAS实验，选取同亲C57BL/6J雄性小鼠8只，体重18～22 g，7～8周龄。安静环境饲养，自由取食饮水。实验中，将上述小鼠随机均分成对照组，磁声耦合刺激组，每组4只。首次实验时剃除小鼠头部外层毛发，并使用生理盐水冲洗清洗干净皮肤。每次实验开始前，先使用4%浓度的异氟烷对实验小鼠进行诱导麻醉。使小鼠被脑立体定位仪固定，固定后改为1%浓度异氟烷维持麻醉状态。在小鼠头部皮肤涂抹超声耦合剂，将小鼠置于2.2实验系统中。其中磁声耦合刺激组将小鼠脑部置于强度为0.3 T的水平方向静磁场下，同时超声换能器使用2.3中的参数在海马区黑质竖直方向发射超声波，持续2 min，每d 1次，连续10 d。对照组小鼠仅固定在脑立体定位仪上，将换能器置于头皮上，并关闭超声激励，持续2 min，每d 1次，连续10 d[5-6]。

2.4.2PD模型小鼠的TMAS实验 实验中使用8只由腹腔注射MPTP造模形成的PD模型鼠，全部通过爬杆测试完成PD验模[7]。也将该8只PD小鼠随机分为对照组，TMAS组，每组4只。实验中使用的刺激参数与刺激方案均与2.4.1中的健康鼠实验方案相同。

3 动物实验结果及讨论

3.1 健康小鼠的TMAS实验结果

在刺激结束之后2 d，即从开始刺激起第12 d，对实验鼠进行了高架十字迷宫实验以及旷场实验，对其主动学习与探索记忆能力进行检测。

高架十字迷宫由两个相对的开放臂，两个相对的封闭臂组成的十字型迷宫，放置在离地50 cm的支架上。实验利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突来考察动物的焦虑状态，实验指标主要关注进入开放臂探索的距离和在开放臂停留时间的百分比。实验结果见图4。

图4 高架十字迷宫实验结果

a.各组小鼠在开放臂停留时间百分比 b.各组小鼠在开放臂运动距离(cm)(对照组为C，磁声刺激组为M)

Fig4Resultsofelevatedplusmazetest(C：controlgroup，M：TMASgroup)

a．the percentage of time mice stay in open arm b．the distance mice progress in open arm

在开放臂中向下探究的时间百分比反应在动物的探索行为，代表动物对陌生环境的好奇探索或逃避；进入开放臂探索的距离反应动物的运动能力[8-9]。

图5各组小鼠在旷场中心停留、探索时间(对照组为C，磁声刺激组为M)

Fig5Durationsofmicestayatthecenterofopen-field(C:controlgroup，M:TMASgroup)

旷场实验系统可以观察研究动物进入开阔环境后的各种行为，以此评价实验动物在新异环境中的自主探究行为。

图5中实验结果表明，磁声刺激组小鼠在主动探索学习能力方面和运动能力方面显著高于对照组。仅从行为学的结果来看，磁声耦合刺激对脑海马区灰质神经确实有一定的改善作用。

3.2 PD模型小鼠的TMAS实验结果

刺激结束后2 d，即开始刺激后的第12 d，对各组小鼠进行脑海马区突触活性的长时程增量(LTP)和去长时程增量(DP)电生理检测[10]。

图6各组PD小鼠LTP与DP结果(对照组为PC，磁声耦合刺激组为PM)

Fig6ResultsofLTPandDPcollectedfromdifferentgroup(C:controlgroup，M:TMASgroup)

海马突触活性的长时程增强作为突触可塑性的研究模型，与动物的学习记忆能力有着十分直接的联系，在图6中记录的兴奋性突触后场电位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)可以看出，在给予海马区神经突触高频节律刺激(TBS)之后，成功诱发出LTP，并且磁声组模型鼠的fEPSP的增强速率明显高于对照组。在给予低频刺激(LFS)后，引起DP后，磁声刺激组fEPSP回升速率较快。

上述结果均表明经颅磁声耦合刺激可以有效地调节PD模型鼠海马区黑质神经，使其突触活性及可塑性提高，从而提高学习与记忆能力[11]。

3.3 动物实验结果的讨论及分析

经颅磁声刺激本质上是一种聚焦电刺激。本研究由图4、5、6可知，利用经颅磁声耦合刺激在小鼠脑黑质区作用10 d后，无论健康鼠还是PD模型鼠，其运动功能以及学习记忆能力均得到改善，改善的效果为TMAS组优于对照组。初步证明了TMAS技术对小动物经颅聚焦刺激的有效性。

本实验中，由于TMAS技术中同时产生超声刺激和磁声耦合电刺激的神经刺激，作用的效果可能仅由电刺激作用直接引起，也可能是由超声刺激的辐射力效应间接引起，还有可能是两者共同作用的综合效应。

在使用本系统的超声信号进行TMAS时，实验中小鼠颅内瞬时声压达到3.1 MPa，系统中静磁场的强度B0=0.3 T，Cs=1515 m/s，ρ=1028 kg/m3，σ=0.5 S/m[12]，根据磁声耦合效应产生的电场与电流密度公式可以得出，其电场强度为0.597 V/m，电流密度为0.299 A/m2。由此可知，在现有实验前提下，实际刺激中在目标神经区域产生的电场强度远小于经典的直接电磁刺激技术，如TMS以及DBS，并未达到神经动作电位阈值(参考文献[13-15]，一般认为能引起神经动作电位的阈值为100 V/m)，属于阈下刺激。

经颅聚焦超声刺激(transcranial ultrasound stimulation,TUS)的机制[16-18]已经被多次阐述，通过机械效应改变细胞离子通道阈值，进而影响神经细胞活动。根据参考各课题组在TUS领域所做的研究，TUS中超声参数的选择更加注重的是超声所携带的能量[19-20]，而非磁声耦合电刺激中的声压。本实验中所选用的超声参数虽瞬时声压较高，但是实际占空比低，超声所携带的平均能量较低，Ispta=63 mW/cm2，超声能量十分微弱。

综上论述，本研究开展动物实验证明了TMAS的有效性。由在体动物实验结果，我们初步认为，TMAS技术是结合了超声刺激的力学机械效应与磁声耦合电场的电学效应，其本质上是在刺激靶区产生这两种效应的复合效果。对于TMAS的作用效果及机制仍需更深入的探讨，这也是我们未来的主要研究工作。

4 总结

本研究根据经颅磁声耦合刺激原理，搭建小动物TMAS实验系统，进行小动物在体实验，刺激后的行为学及电生理结果验证了TMAS在在体动物上可有效改善运动功能，提高神经突触活性，并基于动物实验结果分析及讨论了TMAS的作用机制。本研究的结果对TMAS的在体应用有一定的参考价值，为进一步分析TMAS作用于神经的实际效果机制打下了基础。