氧氟沙星滴眼液细菌内毒素检测法研究
2018-10-17陈日檬梁凤兰马德运颜月娥杨建芳
陈日檬，梁凤兰，马德运，李 蔚，颜月娥，杨建芳
（1.湛江市食品药品检验所，广东 湛江 524022；2.肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061；3.肇庆学院 化学化工学院，广东 肇庆 526061；4.哈尔滨工业大学后勤集团，黑龙江 哈尔滨 150006）
《中国药典》（2015版第二部）规定滴眼液只需进行无菌检测，而无菌检测仅局限于检查样本中存在的活体菌株，对死亡细菌释放出的内毒素检测未做规定.眼睛作为人体极为敏感的部位，如果存在创伤面或者处于发炎状况，那么滴眼液中可能存在的内毒素就会通过伤口进入人体血液.研究显示人体对细菌内毒素极为敏感：极微量（1 kg体质量中含1～5 ng）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4 h后逐渐消退.内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞、中性粒细胞等，使之产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因子α等细胞因子，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热.当进入人体的细菌内毒素超过一定剂量，可引发严重的内毒素血症，严重者可造成休克死亡[1].滴眼液生产采用了无菌生产工艺，一般通过过滤方式去除了活体菌株，但无法去除可能存在的内毒素，从而极有可能使存在创伤面或者处于发炎状态的眼睛受到感染.但目前滴眼液内毒素检测未设立相关标准，因此有必要建立滴眼液中细菌内毒素检测方法.研究采用鲎试剂凝胶法对氧氟沙星滴眼液细菌内毒素进行检测，为产品质量控制提供参考方法与标准，从而有效保证滴眼液产品的安全性.
1 材料及实验条件
1.1 仪器
BET-16M细菌内毒素测定仪（天津市天大天发科技有限公司），ZH-2 BLENDER旋涡混匀器（广州易测仪器有限公司），MX-S可调试混匀器（广州易测仪器有限公司），GR-246热空气消毒箱（上海博讯实业有限公司），SW-CJ系列洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）.
1.2 试剂和样品
细菌内毒素工作标准品（冻干）（中国食品药品检定研究所，批号：150601-201176，规格：100 EU/支），鲎试剂（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1302180、1406270，灵敏度：0.25 EU/mL），细菌内毒素检查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1408060），碱性调节剂（湛江博康海洋生物有限公司，批号：1405270，规格：2 mL/支）.
1.3 样品
氧氟沙星滴眼液（江苏克胜药业有限公司，批号：130303），氧氟沙星滴眼液（参天制药（中国）有限公司，批号：130306），氧氟沙星滴眼液（江苏亚邦爱普森药业有限公司，批号：130311）.
1.4 实验条件
实验环境：SW-CJ系列洁净工作台，实验温度：37±1°C，反应时间：1 h.
2 凝胶法实验及结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核
用细菌内毒素检查用水（BET水）溶解细菌内毒素工作标准品（WES），用旋涡混匀器将WES混匀15 min制成内毒素标准溶液，浓度为0.5、0.25、0.125和0.0625 EU/mL，每稀释一步都必须混匀30 s，并以BET水作为阴性对照.
2.1.1 细菌内毒素工作标准品溶液配制
按图1 所示操作流程，制成2.0 λ (0.5 EU/mL)、1.0 λ (0.25 EU/mL)、0.5 λ (0.125 EU/mL)、0.25 λ (0.062 5 EU/mL)的内毒素标准溶液.
图1 细菌内毒素工作标准溶液配制流程
2.1.2 检测操作与结果
取不同批号的鲎试剂各18支，分别加入BET水0.1 mL溶解，其中每批鲎试剂各取16支分别加入上述4个浓度的内毒素标准溶液0.1 mL，每个内毒素浓度平行做4支，另2支加入0.1 mL检查用水作为阴性对照，结果见表1.
表1 灵敏度复核结果
灵敏度计算公式：鲎试剂灵敏度的测定值λc=lg-1(∑X/4).
由表1结果可见，最大的浓度2λ均为阳性，最低的浓度0.25λ均为阴性，阴性对照为阴性，试验有效[2].计算2批鲎试剂的灵敏度都为0.149，处于0.5～2λ（0.125～0.5 EU/mL）范围之间，则该2批鲎试剂可用于实验检测.
2.2 供试品细菌内毒素限值（L）的确定
《中国药典》（2015版第四部）通则规定了细菌内毒素限值的品种为注射液，而滴眼液作为细菌内毒素检测新品种在药典上并没有明确规定，故在此参照氧氟沙星原料药细菌内毒素限值，每1 mg样品细菌内毒素应小于0.75 EU[3]，则氧氟沙星滴眼液的细菌内毒素限值L为0.75 EU/mg.
2.3 供试品最大有效稀释倍数（MVD）的确定
按照公式MVD=L*C/λ且本品的标示量为5 mL，供试品浓度为3 g/L，λ为0.25 EU/mL.计算可得9倍为氧氟沙星滴眼液供试品的最大有效稀释倍数（MVD）.
2.4 供试品的干扰初筛试验
用BET水作为稀释液，将氧氟沙星滴眼液分别稀释成9、7、5、3、1倍的系列浓度，再以各稀释倍数浓度的供试液将内毒素工作标准品（WES）制成内毒素标准溶液浓度分别为0.5、0.25、0.125和0.062 5 EU/mL，加入鲎试剂混合，进行抑制试验.
2.4.1 氧氟沙星滴眼液样品稀释液制备
取样品和检查用水各1 mL混匀，制成1:1溶液，然后取1:1溶液的1 mL加入检查用水0.5 mL制成1:3溶液，然后取1:3溶液的1 mL加入检查用水0.7 mL制成1:5溶液，再取1:5溶液的1 mL加入检查用水0.4 mL制成1:7溶液，最后取1:7溶液的1 mL加入检查用水0.3 mL制成1:9溶液.
2.4.2 细菌内毒素工作标准品溶液制备
细菌内毒素工作标准品溶液制备的操作按照2.1.1方法.
2.4.3 检测
每一浓度的稀释液分别取鲎试剂各18支，分别以0.1 mL检查用水加入于其中16支，溶解，分别加入0.1 mL相应浓度（1、3、5、7、9倍）的供试品稀释液，每个内毒素浓度分别平行做4支；另外2支分别加入0.1 mL相应浓度的稀释液作为阴性对照，结果见表2.
表2 供试品的干扰初筛结果
如表2所示，供试品原液对实验凝胶呈抑制，供试品稀释5倍时，符合当最大浓度2 λ均为阳性，最低浓度0.25 λ均为阴性，阴性对照为阴性，试验视为有效的规定.故样品稀释至5倍以上时实验不产生干扰，可用做正式干扰试验.
2.5 供试品的正式干扰试验
用5倍样品稀释液和BET水分别将内毒素工作标准品（WES）制成内毒素标准溶液，浓度为0.5、0.25、0.125和0.0625 EU/mL，分别以2批鲎试剂（λ为0.25EU/mL）进行干扰试验.
2.5.1 氧氟沙星滴眼液的5倍稀释液的制备
按照2.4.1方法操作.
2.5.2 细菌内毒素工作标准品溶液制备
按照2.1.1方法操作.
2.5.3 检测
取2批号鲎试剂各36支，加入BET水0.1 mL溶解，分别加入0.1 mL 5倍样品稀释液制成的4个浓度的内毒素标准溶液于其中16支，实验平行做4支，另取2支分别加入5倍样品稀释液0.1 mL作为供试品阴性对照；再另取16支分别加入0.1 mL BET水制成的4个浓度的内毒素标准溶液，阴性对照为剩余2支加0.1 mL BET水的反应管，结果见表3.
表3 供试品的正式干扰结果
2.5.4 计算
2批鲎试剂BET水系列溶液和5倍样品稀释液系列溶液反应终点浓度几何平均值（Es和Et1、Et2）为
同上计算，鲎试剂批号：1302180，Et1=0.149 EU/mL;鲎试剂批号：1406270，Et2=0.177 EU/mL.
根据《中国药典》（2015版第四部）通则规定，当Es在0.5～2.0 λ范围内，且Et也均在0.5～2.0Es范围内（包括0.5Es和2.0Es），则认为供试品在该浓度下无干扰.由上述计算结果可见，Es=0.149在0.5～2.0 λ（即 0.125～0.5 EU/mL）范围内，Et1=0.149、Et2=0.177也均在 0.5～2.0Es（即0.074 325～0.297 302EU/mL）范围内，则实验无干扰，即5倍的样品稀释液可以用于样品细菌内毒素限度检测.
2.6 细菌内毒素分析方法的确立
取3批不同批号氧氟沙星滴眼液样品，分别用BET水稀释5倍，采用2批不同批号鲎试剂对样品稀释液进行细菌内毒素检测，从而确立氧氟沙星滴眼液中细菌内毒素限度分析方法.实验过程如下：
2.6.1 制备5倍样品稀释液
依照供试品的正式干扰试验项下样品稀释操作.
2.6.2 内毒素工作标准品溶液制备
2.6.3 检测：
分别取2批鲎试剂各8支，分别加入0.1 mL检查用水溶解，其中2支管平行加入其中一个样品稀释液0.1 mL，2支管平行加入供试品阳性溶液0.1 mL作为阳性对照，2支管平行加入标准品溶液作为阳性，最后2支管平行加入检查用水0.1mL作为阴性.同法测定另外两批样品，结果见表4.
从表4可见，供试品阳性对照管（PPC）和阳性对照管（PC）均为阳性，阴性对照管NC均为阴性，试验有效.供试品（S）管均为阴性，表明氧氟沙星滴眼液样品中未检测出细菌内毒素，3批氧氟沙星滴眼液样品中的细菌内毒素均符合规定.
表4 氧氟沙星滴眼液细菌内毒素检查结果
3 结果与讨论
在内毒素凝胶法检测中，通过干扰试验得出5倍样品稀释浓度是可以排除干扰的，说明细菌内毒素鲎试剂凝胶法能用于氧氟沙星滴眼液样品细菌内毒素检测.由细菌内毒素鲎试剂凝胶法检查结果可见，氧氟沙星滴眼液样品中未检测出细菌内毒素，3批不同氧氟沙星滴眼液样品中的细菌内毒素均符合规定，故鲎试剂凝胶法可应用于氧氟沙星滴眼液细菌内毒素检测.
本实验操作过程简便、快速、灵敏，可靠性高，鲎试剂凝胶法可作为滴眼液的内毒素检测手段，可供相关生产企业对滴眼液的质量控制，保证产品的安全性.
