茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析

单睿阳，林郑和，陈志辉，钟秋生，游小妹，陈常颂



茶树细胞色素P450基因与的克隆及差异表达特征分析

单睿阳，林郑和，陈志辉，钟秋生，游小妹，陈常颂*

福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015

利用NCBI茶树转录组数据库，以铁观音芽叶为材料，克隆了茶树细胞色素P450基因6与的cDNA全长。与的cDNA全长分别为1 879 bp和1 764 bp，分别含有1 539 bp（编码513个氨基酸）和1 533 bp（编码511个氨基酸）的完整开发阅读框。氨基酸序列比对结果显示，CYP71A26与CYP71B34的同源性为42.47%，为2个亚家族基因。氨基酸结构分析表明，2个基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺线I（Helix I）、螺线K（Helix K）、“Meander”区域序列和血红素结合域（Heme binding domain）的典型结构。进化树分析显示，与在分子进化树上分属两大分支，2个基因与其他物种亲缘关系的远近不同。三级结构模拟与功能域分析显示，CYP71A26与CYP71B34主要由N端的折叠和C端的螺旋结构组成，且2个基因均具有一个P450蛋白结构域（Pfam domain）。荧光定量PCR结果表明，与基因在不同茶树害虫为害的叶片中，分别表现出上调和下调表达的现象。而在冷热环境下，与基因分别表现出下调和上调表达的现象。表明茶树与基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应，但两个基因表达相反，参与环节可能相反。

茶树；细胞色素P450；克隆；亚家族基因；胁迫；表达相反

细胞色素P450（Cytochrome P450，Cyt P450）是一类以血红素为辅基的超家族酶系，该酶系多存在于生物体的内质网（Endoplasmic reticulum）、高尔基体（Golgi complex）和质体（Plastid）等细胞器膜中。最早发现P450是在50年代，Axelrod[1]在研究肝脏时发现细胞微粒体中存在一些能够参与氧化代谢的酶系，进而Garfinkel[2]发现该酶系能与一氧化碳（CO）结合，并在450 nm附近有最大吸收峰，故将其命名为细胞色素P450。到了60年代，Omura等[3]证实了该酶系属于b型血红色素蛋白（Haemoglobin）。70年代，开始对P450酶的纯化及特异性抗体的制备进行了研究。80年代，开启了对P450基因的克隆、分子鉴定以及功能的研究。近20年来，P450的研究取得了突飞猛进的发展。

在植物P450超家族基因簇中，最大的是CYPA71簇（简称植物A-type P450集团，又称71 clan），这个基因簇基本上包含了超过半数的P450基因[4]，目前在水稻、玉米、拟南芥、番茄、大豆、松树等植物中发现该基因簇具有复杂的生物学功能[5]。根据前人研究结果，大致可将这些功能归为两类：一类是起到内源性物质的转化合成功能，如在苯丙烷类（Phenylaprapanoid）、植物激素类（Phytohormone）、萜类（Terpene）、黄酮类（Flavonoid）、木质素（Lignin）和生物碱（Alkaloid）等的物质合成过程中起到重要的作用[6]。这些通过代谢途径合成的内源性物质，有的可以作为毒素或者杀虫剂，使植物对昆虫、病原菌产生抗性。有的可以作为信号分子，激活植物对病菌的抗性。另一类是对外源性物质的代谢解毒功能，它可催化外源物质如杀虫剂、除草剂和环境污染物等的代谢降解。例如，小麦对苯基脲类（Phenylureas）除草剂绿麦隆（Chlortoluron）的代谢主要是通过P450的环甲基羟基化（Cyclomethylhydroxylation）所介导[7]。水稻对苄嘧磺隆（Bensulfuron-methyl，BSM）的降解主要通过P450的脱甲基（Demethylation）作用所催化[8]。

茶树[(L.) O. Kuntze]属多年生常绿木本植物，是我国重要的经济作物之一。选育抗虫、抗病性强的茶树新品种是茶树育种的首要工作任务，而P450具有复杂的生物学功能，因而许多P450基因已被克隆并鉴定，并应用于作物的遗传育种。如从拟南芥中克隆得到的已被广泛应用，该基因所产生的植保素在作物抵抗病菌侵染过程中发挥重要的作用[9]。因而，筛选及研究茶树P450基因的分子功能具有重要的意义。基于此，本研究利用NCBI已上传的茶树转录组数据库（Taxonomy ID：4442），从中筛选出了茶树（GenBank登录号：GARM01003853.1）与GenBank登录号：KA281555.1）的2个基因片段，通过RT-PCR及RACE技术，克隆了该2个基因全长。通过生物信息学软件和在线网站分析了该2个基因的理化性质、氨基酸结构、进化树和功能域等信息。最后，检测了该对基因在不同茶树害虫为害的叶片中及冷热环境下的表达差异。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

本试验所使用的材料铁观音茶树品种采集于福建省农业科学院茶叶研究所2号山品种茶园（北纬27°8′~27°13′40″，东经119°32′11″~119°38′之间）。植物总RNA提取试剂盒RNAprep pure plant kit (dp441)、反转录试剂盒FastKing RT Kit（With gDNase）、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和荧光定量试剂盒FastFire qPCR PreMix（SYBR Green）均购自天根生化科技（北京）有限公司；全长cDNA克隆试剂盒SMARTer®RACE 5′/3′Kit购自TaKaRa公司；dNTPs（各2.5 mmol·L-1）、Taq DNA聚合酶、DNase/RNase Free Water、DL2000 Marker、T4 DNA连接酶、pMD18-T、X-gal和IPTG等均购自Invitrogen公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞由本实验室保存；克隆引物、定量引物的合成以及碱基序列的测序均由上海铂尚生物技术有限公司完成。

1.2 总RNA提取及cDNA模板的合成

取适量生长健壮、长势均匀的铁观音嫩叶（一芽一叶），将其液氮冷冻后研磨成粉，按照植物总RNA提取试剂盒（RNAprep pure plant kit，dp441）说明书的操作步骤提取茶树总RNA，再用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用超微量分光光度计（NanoDrop 2000）检测RNA的纯度。最后，以提取的总RNA为模板，按照反转录试剂盒（FastKing RT Kit，With gDNase）的操作步骤，将其反转录成cDNA第一链，即用于普通RT-PCR扩增的cDNA模板。

1.3 茶树CYP71A26与CYP71B34基因中间片段的克隆

登入NCBI物种分类学数据库（Taxonomy database），根据已登入的茶树转录组数据库（Taxonomy ID：4442）信息，下载获得茶树的所有mRNA序列。该数据库包含34万多条不完整的核酸序列，且无详细基因命名信息，因而无法迅速找到所要研究的目的基因序列，故需要通过Windows系统建立单机版的茶树本地Blast数据库，再以P450为关键词，通过序列的分析比对获得本研究所需的（GenBank登录号：GARM01003853.1）与（GenBank登录号：KA281555.1）基因序列。详细建库方法参照华大基因的“Windows系统下本地Blast的实现”（www.genomics.cn）说明书。

进而根据已获得的茶树与的基因序列，分别设计1对简并引物71A-F1/R1与71B-F1/R1（表1），以反转录合成的茶树cDNA为模板进行RT-PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃，保存。之后，将目的条带进行回收并与载体pMD18-T进行连接，在大肠杆菌DH5α感受态细胞中成功转化后，挑取白斑培养成菌液并委托上海铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.4 茶树CYP71A26与CYP71B34基因的5'及3'RACE扩增

在获得茶树与中间片段的基础上，分别在5'端设计1对内外镶嵌引物71A-R2-inner与71A-R3-outer及71B-R2-inner与71B-R3-outer用于前端的5'RACE扩增，以及在3'端设计1对内外镶嵌引物71A-F2-inner与71A-F3-outer及71B-F2-inner与71B-F3-outer用于尾端的3'RACE扩增（表1）。5'RACE反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸90 s，共39个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。3'RACE反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共33个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。最后将所获得的各段序列进行拼接，获得茶树与的基因全长。

表1 本研究所用到的引物

注：F指正向引物，R指反向引物，inner指镶嵌内引物，outer指镶嵌外引物。

Note: F represents positive primers, R represents negative primers, inner represents inside inlay primers, outer represents outside inlay primers, respectively.

1.5 茶树CYP71A26与CYP71B34基因的生物信息学分析

利用DNAstar 8.0软件对茶树与的全长进行拼接；利用ProtParam在线工具（http://web.expasy.org/protparam）对编码区蛋白的分子式及理化性质等进行分析。利用Multalin 5.4.1在线网站（http://multalin. toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）比对CYP71A26与CYP71B34蛋白的氨基酸结构；三级结构由Swiss Model网站（http://www. swissmodel.expasy.org）分析获得；蛋白功能域及跨膜结构由Smart在线网站（http://smart. embl-heidelberg.de）分析得到；系统进化树由MEGA 5.0软件的邻位相连法（Neighbor- joining, NJ）构建得到。

1.6 茶树CYP71A26与CYP71B34基因的表达检测

1.6.1 样品处理及取样

选取生长健壮，大小均匀的半年生茶苗，参照曹红利等[10]的水培方法，于人工气候室内，于(23±0.5)℃，RH 70%，16L∶8D条件下，于小塑料柱形盆（直径40 cm，高30 cm）中水培茶苗。水培营养液的全配方参照Ruan等[11]。待茶苗培养2~3周，茶树生长稳定后，进行处理取样。

试验处理分2组：（1）以铁观音为实验材料，采集茶园常见害虫茶尺蠖（）、小贯小绿叶蝉（）、茶橙瘿螨（）和茶长卷叶蛾（），每盆茶苗接入适量虫口量（每个虫害处理3盆，共15盆），再将茶苗放入人工气候箱中，于(24±1)℃，RH 75%，12L∶12D条件下为害48 h后，于为害部位剪取约1 g的一芽一叶新鲜茶样，以未受害虫为害的茶苗为对照，检测与基因是否受虫害所影响。（2）参照以上步骤，将铁观音茶苗放入4℃和36℃人工气候箱中，分别于12、24、36、48 h取样，以0 h未经温度胁迫的茶苗为对照，检测与基因冷热胁迫后的表达情况。

1.6.2 qRT-PCR表达检测

1.7 数据统计与分析

荧光定量PCR每组设置3个重复，数据处理采用means±SE的计算方法，取平均值于GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software）软件中进行作图。每组数据的差异显著性分析结果（<0.05）由SPSS 13.0软件中的邓肯氏（Duncan’s multiple range test）单因素方差（One-way ANOVA）分析方法获得。

注：M1—M6泳道：DL2000 DNA Marker，1—2泳道：与的中间片段克隆，3—4泳道：与的5'RACE产物，5—6泳道：与的3'RACE产物。

Note: Lane M1-M6: DL2000 DNA Marker. Lane 1-2: Intermediate fragment cloned ofandgene. Lane 3-4: 5'RACE product ofandgene. Lane 5-6: 3'RACE product ofandgene.

图1 茶树和基因的cDNA全长克隆

Fig. 1 Cloning of the full length cDNA ofandgenesin

2 结果与分析

2.1 茶树CYP71A26与CYP71B34基因的全长克隆

利用茶树转录组数据库中已知的与序列信息，通过RT-PCR技术克隆得到1 735 bp（图1-泳道1）和1 154 bp（图1-泳道2）的与中间序列。然后，通过5'RACE技术克隆得到309 bp（图1-泳道3）和664 bp（图1-泳道4）的与头部序列。再通过3'RACE技术克隆得到452 bp（图1-泳道5）和573 bp（图1-泳道6）的6与尾部序列。最后，去除重复序列，拼接得到1 879 bp和1 764 bp的与全长序列。采用DNAstar对基因全长进行分析，结果表明与分别含有1 539 bp （编码513个氨基酸）和1 533 bp（编码511个氨基酸）的ORF序列。通过ProtParam网站进一步分析了编码蛋白的理化性质，结果表明，茶树CYP71A26与CYP71B34的蛋白分子式分别为C1772H2803N481O526S12和C2687H4161N701O738S23，分子量分别为39.65 kDa和58.83 kDa，理论等电点分别为5.19和7.99，以及包含354和510个氨基酸残基数。

2.2 茶树CYP71A26与CYP71B34基因的生物信息学分析

2.2.1 氨基酸结构分析

为明确茶树与基因的ORF序列特征，将这2个基因的氨基酸序列制成faste文档，并导入Multalin 5.4.1在线网站进行比对分析。结果表明，与的同源性为42.47%，且2个基因均具有植物P450的典型结构，其中包括1个螺旋C（Helix C）序列“WxxxR”，1个螺线I（Helix I）序列“(A/G)Gx(D/E)T(T/S)”，1个螺线K（Helix K）序列“ExxR”，1个“Meander”区域序列“PxxFxPxxF”和1个血红素结合域（Heme binding domain）序列“FxxGxRxCx(G/A)”（图2）。

2.2.2 系统进化树分析

采用MEGA 4.0软件中的邻位相连法（Neighbor-joining，NJ），将茶树与基因的开放阅读框所推导的氨基酸序列与NCBI库中其他物种和进行比对并下载构建了系统进化树（图3）。从图3可以看出，与基因在分子进化树上分属两大分支，分为两大聚类（分别用“○”和“△”标注，其中“○”标注的为基因，“△”标注的为基因。进一步分析结果表明，茶树与大戟科的蓖麻（）（XP_002511297.1）和麻疯树（）（XP_012079955.1）亲缘关系较近，而与葡萄科的葡萄（）（CAN67678.19）亲缘关系较远。然而有趣的是，茶树基因却与葡萄科的葡萄（）（XP_002279272.2）亲缘关系较近，而与大戟科的巴西橡胶树（）（XP_021664607.1）亲缘关系较远。

2.2.3 三级结构模拟与功能域分析

通过Swiss Model对茶树与基因编码蛋白的三级结构进行模拟，结果表明，茶树CYP71A26（图4-A）与CYP71B34图4-B）主要由N端的折叠（图4中的红色部分）和C端的螺旋结构组成（图4中的绿色部分）。另外，CYP71A26与CYP71B34蛋白三级模型的GMQE（Global Model Quality Estimation，全球性模型质量估测）值分别为0.63和0.61（GMQE值在0~1之间，越接近1，建模质量越好），表明建模可信度高。

注：红色和黑色分别代表两基因具有相同和不同的氨基酸序列，方框所圈氨基酸分别为：螺旋C、螺旋I、螺旋K、“Meander”区域和血红素结合域序列。

注：圆圈和三角形分别代表不同植物的CYP71A26和CYP71B34基因，树中所呈现的数字越大代表不同物种亲缘关系越近。

通过SMART网站，进一步分析了茶树CYP71A26与CYP71B34蛋白的功能结构域（Functional domain structure）。结果表明，CYP71A26与CYP71B34均具有1个P450蛋白结构域（Pfam domain），分别位于各自编码序列的第37~505（图5-A中的黑色部分）和39~496（图5-B中的黑色部分）位点上。另外，CYP71A26蛋白含有1个由“FSLLHPFFLSLLPLFFFTLLLL”组成的低复杂度区域（Low complexity）（图5-A中的紫色部分），位于编码序列的第2~23位点上。以及CYP71B34蛋白含有1个跨膜区结构（Transmembrane structure）（图5-B中的蓝色部分），位于编码序列的第7~29位点上。

注：红色部分为N端的β折叠结构，绿色部分为C端的α螺旋结构。

注：数字代表氨基酸位置。Note: Numbers represent the amino acid position.

2.3 茶树CYP71A26与CYP71B34基因的胁迫表达分析

2.3.1 不同虫害胁迫的表达检测

以铁观音为实验材料，以未受虫害取食的叶片为对照，研究茶尺蠖（）、茶橙瘿螨（）、小贯小绿叶蝉（）和茶长卷叶蛾（）为害茶树叶片48 h后，与基因的表达是否受虫害所影响。结果显示（图6），受上述茶园害虫为害后，茶树基因分别上调了1.37、1.52、2.19和2.88倍，而茶树基因分别下调了20.63%、8.26%、11.51%和69.23%。这表明，茶树与基因分别受虫害所诱导和抑制，表达相反。

2.3.2 冷热胁迫的表达检测

以铁观音为实验材料，以常温正常生长的茶树为对照，研究茶树与基因的表达是否受冷（4℃）、热（36℃）胁迫所影响。结果显示，茶树基因在冷热条件胁迫下表达量均呈下降的趋势，且随着时间的推移表达量下降越明显，在48 h时分别下降了91.39%（冷）和87.06%（热）（图7-A）；相反的，茶树基因在冷热条件胁迫下表达量却呈上升的趋势，且随着时间的推移表达量上升越显著，在48 h时分别上升了20.22倍（冷）和7.63倍（热）（图7-B）。

图6 不同害虫取食茶树后CYP71A26与CYP71B34基因的相对表达量

注：试验以茶树GAPDH基因为内参，数据处理方法采用平均值±标准误，每组试验重复3次，柱上不同字母代表不同组数据间的显著性差异（P<0.05）。

3 讨论

P450广泛存在于动植物体中，由于P450具有超家族特性，因而在命名时根据编码氨基酸序列的相似性将其分类命名。若氨基酸同源性大于40%则为同一家族，大于40%小于55%则为同一亚家族基因，大于55%则为同一亚家族的不同异构体[12]。虽然不同家族P450的氨基酸序列差异较大，但其三级结构却是类似的，均由N端的折叠和C端的螺旋构成。不同P450的主要功能域位点相当保守，特别是与半胱氨酸（Cys）相连，起到接受电子的血红色结合位点（Heme binding domain）、与氧原子或底物分子形成活性中心的螺线I（Helix I）、与血红素形成电子拉链的螺旋C（Helix C）、具有稳定血红素核心结构作用的螺线K（Helix K）和“Meander”区域序列[13]。本研究通过比对分析了茶树与基因的氨基酸序列，发现两基因的同源性为42.47%，且均具有上述保守序列结构。进一步分析了该对基因的功能域，发现两基因均具有1个P450蛋白结构域，从而验证了与为两个经典的亚家族P450基因。

系统进化树分析发现，茶树与大戟科亲缘关系较近，与葡萄科亲缘关系较远，而基因却与之相反。该现象可能与植物P450的碱基易变性有关。如前人研究结果表明，水稻基因具有调控花粉壁形成的功能，但该基因在第4个外显子处经常发生多碱基替换或缺少，导致天冬氨酸（Asp）转变为甲硫氨酸（Met）并造成缬氨酸（Val）的缺失[14]。而调控水稻枝梗延伸和小穗发育的1基因，经常在第一个外显子处发生碱基突变或缺失，导致提前出现终止密码子[15]。因此，不同物种之间的与可能在进化过程中发生碱基突变，而导致氨基酸序列发生改变，从而导致该对基因的分子进化树发生偏离。

P450酶系是自然界中最具催化活性的生物催化剂之一，但大多数植物P450基因在各组织中的表达量较低，特别是一些参与内源信号分子代谢途径的P450，很多需经外界生物胁迫（如病虫害）后才响应表达。如Wang等[16]研究发现，当烟草受蚜虫（）为害后，烟草腺毛中能诱导表达1个特异的P450基因，该基因可催化腺毛分泌的西柏三烯一醇转化为西柏三烯二醇，从而提高对蚜虫的抗性。而受棉铃虫（）为害的棉花，能诱导P450催化苯丙烷类的物质代谢，而产生香柠檬烯（Bergapten）和花椒毒素（Xanthotoxin），从而延缓该虫的生长[17]。本研究选取了不同茶树害虫为害后的叶片做了表达检测，发现2个基因均受不同虫害所影响，但呈诱导表达，而基因则受抑制，表明2个基因均参与对害虫的防御作用，但2个基因的调控路径可能相反。

另外，许多P450酶系受外界非生物胁迫（如温度）的响应。如对冷热胁迫后的多年生黑麦草（）进行RNA-seq测序分析，发现大量黑麦草P450基因响应外界温度胁迫，特别是最为敏感。进一步通过亚硫酸盐测序法分析了的甲基化状态，证明了该现象与基因外显子的CG碱基甲基化有关[18]。本研究对冷热胁迫后的茶树做了表达检测，发现茶树基因不管在冷或热胁迫下表达量均下降，而均上升，且随着诱导时间的延长，基因的下降或上升越显著，从而说明该对基因能够响应外界温度的胁迫，但是否与CG碱基的甲基化有关有待进一步研究。

综上所述，本研究克隆了茶树与基因的全长。这2个基因均具有典型的P450序列及功能域，且为2个不同的亚家族基因。分析了该对基因的系统进化树，发现两基因的分子进化树发生偏离。分析了该对基因在不同虫害为害的叶片及冷热胁迫后的表达差异，表明2个基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应，但2个基因表达方向相反，参与环节可能相反。

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Molecular Cloning and Expression Analysis of Cytochrome P450andGenes in Tea Plants ()

SHAN Ruiyang, LIN Zhenghe, CHEN Zhihui, ZHONG Qiusheng, YOU Xiaomei, CHEN Changsong*

Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu′an, 355015, China

The full cDNA sequences of cytochrome P450 genes,andwere cloned fromTieguanyin leaves based on NCBI transcriptome database. The complete cDNA lengths ofandwere 1 879 bp and 1 764 bp, containing the open reading frames (ORF) of 1 539 bp and 1 533 bp, which encoded 513 and 511 amino acids, respectively. The alignment of amino acid sequences showed 42.47% of conservation between CYP71A26 and CYP71B34, which indicated that the two genes belonged to different subfamilies. The structure analysis showed that bothandcontained the classic P450 structure domains, such as helix C, helix I, helix K, Meander and heme binding domain. Phylogenetic tree analysis illustrated that there were two branches of molecular evolution for the two genes with different genetic relationship. Via predicting of their tertiary structures and functional domains, the results indicated that both genes were constituted by-pleated structure in N-terminal,-helix structure in C-terminal, and had a P450 protein structure domain (Pfam domain). qRT-PCR results showed that the expression of two genes in leaves showed opposite trends under pest damage treatments. Moreover, the decrease ofand increase ofin expression levels were detected under cold or thermal stresses. In total,andgenes were respond to biotic (like pest) and abiotic (like temperature) stresses, but the changing trends of the two genes were opposite, which might be correlated with opposite regulation systems.

, cytochrome P450, clone, subfamily gene, stress, expression opposite

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2018)05-450-11

2017-12-08

2018-01-30

国家茶产业技术体系（CARS-19）、中国乌龙茶产业协同创新中心专项（闽教科〔2015〕75号）、省财政厅项目（20151297）、福建省公益科研院所专项（2015R1012-10、2016R1011-3）

单睿阳，男，研究实习员，主要从事茶树遗传育种研究。

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