不同产地抱茎苦荬菜的HPLC指纹图谱研究△

杨非凡，张亚妮，武媛媛，李亚梅，王燕秋，李遇伯*

(1.天津中医药大学 中药学院，天津 300193；2.吉林通化华夏药业有限责任公司，吉林 通化 134000)

抱茎苦荬菜具有清热解毒、镇痛抗炎、凉血消肿之功效，为苦碟子(碟脉灵)注射液的原料药材。苦碟子注射液具有活血止痛、清热祛瘀的作用[1]，临床常用于瘀血闭阻的胸痹、冠心病、心绞痛、脑梗死等。抱茎苦荬菜中的主要化学成分为黄酮类、有机酸类、核苷类、氨基酸类及倍半萜内酯类成分，研究表明其具有抗动脉粥样硬化、扩张冠脉及降低冠脉血管阻力、抗肿瘤活性等药理作用[2-5]。不同产地的抱茎苦荬菜各化学成分含量也有一定的差异，这些差异进而对药效产生了直接影响，因而产生了道地药材与非道地药材之分[6]。有研究证明不同产地抱茎苦荬菜确实存在异质性的物质基础[7]，随着中药注射液安全性备受关注，中药注射液安全性再评价指导原则对中药注射液原药材的质量控制提出了明确要求，所以建立一个有效的中药材质量控制方法就成为了迫在眉睫的任务，而中药指纹图谱作为现代中药质量标准体系的核心技术，是多学科交叉、综合技术手段对复杂物质组成体系质量稳定性进行评价的检测方法[8-15]。抱茎苦荬菜质量标准收载于卫生部药品标准[16]中，但因不同的检测机构及企业所具有的实验条件是不同的，故在具体实验操作时可能存在仪器的不适用性等问题，故本实验对不同产地的抱茎苦荬菜进行HPLC色谱分析，并进行了仪器适用性考察，在使用率最高的Agilent、Waters、Shimadzu三个型号的仪器上进行仪器精密度、方法重复性以及样品稳定性验证，均符合指纹图谱分析方法学要求，最终建立了抱茎苦荬菜的对照指纹图谱。

1 仪器与材料

Agilent Technologies 1200高效液相色谱系统(含四元泵，自动进样器，柱温箱，1260 DAD检测器；美国Agilent公司)；Waters 2695高效液相液相色谱仪(含四元泵，自动进样器，柱温箱，2698 DAD检测器；美国Waters公司)；Shimadzu LC-20AT液相色谱仪(含二元泵，自动进样器，LC-20AT PDA检测器；日本岛津公司)；M320型外接柱温箱(Tianjin Puxiang)。

乙腈(Sigma公司，美国，色谱纯)；甲醇(Sigma公司，美国，色谱纯)；磷酸(天津科密欧化学试剂有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。腺苷对照品(批号：110879-200202)、菊苣酸对照品(批号：111752-200902)，均购买于中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%；木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷对照品由通化华夏药业公司提供，纯度大于98%。抱茎苦荬菜药材(通化华夏药业公司提供)均经天津中医药大学王玉明专家鉴定为菊科植物抱茎苦荬菜Ixerissonchifolia(Bge.)Hanc。样品清单如表1所示。

表1 抱茎苦荬菜样品清单

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液制备 取抱茎苦荬菜药材10 g，去除泥土、树枝、伪品等杂物及发霉、变黑、带根的药材，挑选时应注意保护花、叶等药用部位，冲洗至净，切成3～5 cm的段。加10倍量纯净水浸泡1 h，煎煮1 h，第二次加8倍量纯净水煎煮0.5 h，煎煮液合并，加纯净水配制成浓度为每1 mL相当于原生药0.05 g的生药提取液。取配制好的生药提取液(0.05 g·mL-1)，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 取腺苷、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和菊苣酸对照品适量，精密称定，加甲醇-水(25∶75)配制成每1 mL含腺苷5 μg，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷150 μg，菊苣酸60 μg的溶液，即得。所配制的溶液4 ℃保存。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Part No.WAT054275，Lot No.0294353071；检测波长：260 nm；流动相：0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，洗脱梯度如表2所示；流速：1.0 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：40 ℃。

表2 抱茎苦荬菜指纹图谱梯度洗脱程序

2.3 抱茎苦荬菜HPLC指纹图谱共有峰及参照峰筛选

将3个不同产地的抱茎苦荬菜按照2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下的色谱条件测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2.0版，国家药典委员会，2010)进行分析，获得不同产地抱茎苦荬菜指纹图谱叠加图，自动指认共有峰，在已指认的共有峰中手动选择与药效相关的成分以及峰面积较高的9个成分为抱茎苦荬菜指纹图谱的共有色谱峰。按照2.1.2项下方法制备对照品溶液，照2.2项下色谱条件进行测定，选择腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三个与药效有关的成分为参照色谱峰，见图1。

注：峰1.腺苷；峰2.木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰3.菊苣酸。图1 Agilent仪器参照物色谱指纹图谱

2.4 Agilent仪器方法学验证

2.4.1 精密度试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材10.00 g，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件连续进样6次，各特征峰的峰面积RSD均小于2.8%，精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材，按2.1.1项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件进样分析，各特征峰的峰面积RSD均小于2.9%，重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材10.00 g，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件在样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样分析，各特征峰的峰面积RSD均小于2.4%，样品放置24 h稳定。

2.5 Waters仪器方法学验证

2.5.1 精密度试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材10.00 g，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件连续进样6次，各特征峰的峰面积RSD均小于2.9%，精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材，按2.1.1项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件进样分析，各特征峰的峰面积RSD均小于2.8%，重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材10.00 g，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件在样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样分析，各特征峰的峰面积RSD均小于2.9%，样品放置24 h稳定。

2.6 Shimadzu仪器方法学验证

2.6.1 精密度试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材10.00 g，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件连续进样6次，各特征峰的峰面积RSD均小于2.7%，精密度良好。

2.6.2 重复性试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材，按2.1.1项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件进样分析，各特征峰的峰面积RSD均小于2.7%，重复性良好。

2.6.3 稳定性试验 取1605001批抱茎苦荬菜药材10.00 g，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱条件在样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样分析，各特征峰的峰面积RSD均小于2.7%，样品放置24 h稳定。

2.7 HPLC分析及数据导出

将19批药材按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱方法用Agilent、Waters、Shimadzu三台液相色谱仪分析检验，通过仪器自带工作站处理并导出AIA格式色谱数据，仪器的积分参数设置为如下：

Agilent：Slope Sensitivity(斜率灵敏度)5，Peak Width(峰宽)0.05，Area Reject(最小峰面积)1，Height Reject(最小峰高)1；

Waters：阈值50，峰宽30，最小峰面积1000，最小峰高0；

Shimadzu：斜率2000，半峰宽5，最小峰面积/峰高 1000。

2.8 对照指纹图谱建立

打开中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2.0版，国家药典委员会，2010)，工作模式选择生成对照，导入仪器所分析的原始数据；参照图谱参数设置分别为：参照图谱编号为S1，对照图谱生成方法为中位数法，时间窗宽度默认为0.1；在多点校正模块下选择9个共有特征峰；峰匹配方式选择Mark峰匹配；匹配完成后点击生成对照，即可得到对照指纹图谱，将所得的对照图谱保存，以备分析检验时使用。点击匹配数据和计算相似度按钮，查看并保存匹配结果。抱茎苦荬菜对照指纹图谱如图2所示。

2.9 仪器适用性考察

2.9.1 Agilent 仪器 将19批药材按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱方法用Agilent液相色谱仪分析检验，通过仪器自带工作站处理并导出AIA格式色谱数据，仪器的积分参数设置为如2.4项所示，按照2.8项下的方法建立对照指纹图谱，19批药材匹配色谱图如图3所示，共有峰相对锋面积如表3所示。

2.9.2 Waters仪器 将19批药材按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱方法用Waters液相色谱仪分析检验，通过仪器自带工作站处理并导出AIA格式色谱数据，仪器的积分参数设置为如2.5项所示，按照2.8项下的方法建立对照指纹图谱，19批药材匹配色谱图如图4所示，共有峰相对锋面积如表4所示。

2.9.3 Shimadzu仪器 将19批药材按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下所示的色谱方法用 Shimadzu液相色谱仪分析检验，通过仪器自带工作站处理并导出AIA格式色谱数据，仪器的积分参数设置为如2.4项所示，按照2.5项下的方法建立对照指纹图谱，19批药材匹配色谱图如图5所示，共有峰相对锋面积如表5所示。

注：峰1(S).腺苷；峰7(S).木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰8(S).菊苣酸。图2 抱茎苦荬菜对照指纹图谱

注：峰1(S).腺苷；峰7(S).木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰8(S).菊苣酸。图3 Agilent仪器19批药材匹配色谱图

批号12345678913050010.102 0 0.066 6 0.042 5 0.309 5 0.138 2 0.092 4 1 0.848 6 0.170 1 13050020.115 8 0.059 0 0.051 5 0.339 0 0.125 5 0.077 2 1 0.876 2 0.196 2 13050030.097 0 0.061 2 0.049 0 0.351 8 0.096 9 0.076 5 1 0.839 1 0.172 5 13060100.093 7 0.056 9 0.041 7 0.338 9 0.101 8 0.074 0 1 0.800 1 0.105 8 14050010.089 8 0.040 4 0.043 8 0.238 5 0.088 6 0.051 2 1 0.701 8 0.125 0 14050020.162 9 0.098 6 0.087 3 0.376 9 0.196 5 0.096 0 1 0.742 3 0.166 9 14050030.302 2 0.185 2 0.124 8 0.391 2 0.220 9 0.211 9 1 0.735 5 0.194 2 14050040.123 4 0.058 2 0.058 3 0.384 7 0.127 1 0.077 4 1 0.884 1 0.146 4 14060100.114 9 0.080 5 0.055 5 0.441 2 0.136 5 0.063 5 1 1.067 0 0.141 5 14060120.095 1 0.052 6 0.047 0 0.376 3 0.156 2 0.066 0 1 1.063 00.123 1 15050010.100 5 0.062 7 0.054 8 0.282 3 0.080 7 0.035 4 1 0.638 8 0.142 3 15050020.177 4 0.125 2 0.127 2 0.370 6 0.103 3 0.035 9 1 0.876 3 0.190 5 15060030.099 0 0.071 3 0.041 0 0.249 3 0.095 6 0.056 0 1 0.682 4 0.137 2 15060040.116 1 0.064 7 0.054 0 0.326 0 0.129 1 0.086 0 1 0.898 3 0.161 9 16050010.164 8 0.083 6 0.095 3 0.421 7 0.130 3 0.080 8 1 0.970 3 0.150 9 16050020.077 4 0.041 5 0.045 6 0.251 5 0.105 5 0.059 9 1 0.549 2 0.119 1 16060030.352 8 0.249 3 0.265 1 0.617 5 0.197 2 0.083 4 1 0.767 4 0.188 9 16050040.083 2 0.054 6 0.050 7 0.233 1 0.075 0 0.024 1 1 0.425 6 0.159 9 16050060.070 7 0.043 2 0.027 5 0.330 10.104 6 0.062 1 1 0.906 3 0.148 4

图4 Waters仪器19批药材匹配色谱图

批号12345678913050010.249 00.036 10.020 40.276 70.036 90.020 81 1.627 00.616 413050020.117 30.060 90.052 90.474 80.101 80.030 41 1.081 00.174 413050030.086 40.063 80.047 00.426 00.070 10.028 21 1.014 00.161 713060100.084 50.056 00.035 20.409 70.084 20.045 31 0.911 50.091 414050010.073 10.041 60.052 80.310 50.063 10.035 41 0.883 20.115 514050020.156 20.108 80.095 90.546 00.164 90.056 21 0.957 90.164 914050030.437 30.284 00.200 40.784 70.219 20.089 91 1.143 00.245 314050040.093 30.058 90.058 00.496 00.113 30.060 51 1.088 00.130 214060100.109 20.086 20.051 90.594 80.117 90.031 31 1.321 00.137 714060120.085 30.057 00.044 90.542 70.135 70.023 81 1.417 00.105 715050010.104 40.066 70.044 10.403 80.065 70.019 71 0.831 00.131 115050020.167 10.152 30.142 60.590 30.083 00.035 91 1.184 00.190 315060030.078 10.074 80.041 30.362 60.073 50.024 81 0.698 60.149 415060040.106 40.064 00.057 30.480 60.122 00.036 51 1.160 00.143 516050010.138 80.078 70.093 00.476 20.120 20.113 81 1.097 00.150 016050020.053 60.034 40.043 70.274 30.095 60.037 91 0.597 10.114 116060030.214 30.165 90.184 00.525 00.176 20.090 21 0.731 40.147 216050040.066 70.047 70.035 90.285 40.048 70.023 61 0.499 50.141 916050060.044 70.031 00.014 00.357 30.088 90.068 51 1.023 00.125 2

图5 Shimadzu仪器19批药材匹配色谱图

批号12345678913050010.078 00.033 90.031 20.292 10.136 70.095 01 0.843 20.138 013050020.105 30.042 10.047 30.376 40.116 80.061 11 0.890 40.171 013050030.100 50.045 80.049 60.347 80.086 10.059 61 0.846 40.160 013060100.095 40.044 10.044 70.360 80.097 80.045 81 0.843 40.091 914050010.095 30.034 20.050 30.252 00.074 50.037 51 0.786 60.116 714050020.157 20.075 50.092 10.405 40.173 40.042 81 0.793 50.161 914050030.339 00.128 60.149 40.466 90.209 30.132 11 0.799 80.085 414050040.139 10.046 60.064 50.411 90.120 70.049 91 0.921 90.130 314060100.097 20.060 00.052 20.445 90.132 60.045 11 1.065 00.114 814060120.095 40.035 90.041 90.390 20.162 00.058 01 1.091 00.095 215050010.093 60.045 70.053 30.302 30.081 50.034 81 0.691 40.128 215050020.156 30.092 50.133 10.394 70.097 10.030 61 0.914 60.169 815060030.086 90.051 50.045 30.273 20.077 30.028 21 0.701 50.135 015060040.106 10.053 30.056 40.368 10.140 00.059 81 0.965 40.137 116050010.134 40.056 80.082 80.316 40.100 20.054 91 0.685 00.164 016050020.079 70.028 00.046 30.235 70.103 60.042 41 0.520 70.112 016060030.307 20.163 20.236 70.533 60.194 60.059 01 0.651 00.115 916050040.070 90.048 80.041 20.228 90.058 80.014 11 0.413 10.144 216050060.056 30.028 20.021 80.335 00.093 30.025 01 0.982 10.128 6

2.10 小结

Agilent、Waters和Shimadzu三台仪器中19批药材与对照指纹图谱的相似度见表6。

表6 各批次药材与对照指纹图谱相似度结果

可见经Agilent、Waters和Shimadzu仪器分析的各批次药材指纹图谱中均出现了与腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三个参照色谱峰保留时间一致的色谱峰，并出现了9个共有峰，以1(S)、2、3、4、5、6、7(S)、8(S)、9号峰为标记，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与对照指纹图谱相比较，相似度均大于0.95。

3 讨论

本实验建立了抱茎苦荬菜的HPLC指纹图谱，综合抱茎苦荬菜中与药效相关的黄酮类、氨基酸类、有机酸类及核苷酸类成分的吸收波长，选择各类成分均有吸收的波长，最终确定检测波长为260 nm；并进行了仪器精密度、方法重复性、样品稳定性以及仪器适用性验证，符合指纹图谱分析方法学要求。目前对于中药材指纹图谱的研究已经非常广泛，但针对不同仪器间的差异进行考察的还鲜有报道，但众所周知不同仪器的检测结果会有一定差异，故本实验对来自天津蓟县、辽宁海城、河北玉田的19个批次药材在Agilent、Waters和Shimadzu三台仪器中进行指纹图谱检测，均出现了与腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三个参照色谱峰保留时间一致的色谱峰，并指认了9个共有峰，经中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算，与对照指纹图谱相比较，相似度均大于0.95，说明所建立的对照指纹图谱可以用于不同仪器的抱茎苦荬菜指纹图谱分析检验，为该药材的质量鉴定及真伪鉴别奠定了基础，具有很强的实用价值。本实验中用到的三个产地的抱茎苦荬菜都是道地药材，故虽相似度有所差异但都符合要求，后期可用本实验建立的指纹图谱对其他地区的抱茎苦荬菜进行检测，作为其真伪鉴别的依据。