不同狼毒愈伤组织的抑菌活性及化学成分GC－MS分析

肖泽丰，李晓旭，刘名飞，朱昌叁，郝 娜，王俊丽

(中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081)

狼毒(Stellera chamaejasme L.)又名断肠草，是瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属(Stellera)多年生草本植物［1］。有清热解毒、消肿、泻火等功效。狼毒主要成分有黄酮类［2］、二萜类［3－4］、香豆素类及木脂素类［5－6］，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等多种药理作用［7－8］。近年来有关狼毒化学成分和抗肿瘤、抗艾滋病方面的研究取得了迅速的发展，狼毒还被用于生物农药，以毒攻毒取得了明显的效果。现阶段国内研究可采用组织培养技术，通过添加不同植物生长调节剂的方式，可刺激狼毒的次生代谢产物的积累，提高有效药物成分的含量。

本研究对不同生长调节剂培养条件下的狼毒愈伤组织进行乙醇提取，通过抑菌圈法探究醇提物对大肠杆菌(Escherichia coli)、四叠球菌(Micrococcus tetragenus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抑菌活性进行了分析，并通过GC－MS分析其化学成分，以期得出不同植物生长调节剂对其抑菌活性和成分积累的影响，为狼毒的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

野生狼毒植株采自北京市东灵山海拔1 800 m左右的向阳山坡上。所用菌种为大肠杆菌、四叠球菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织醇提物的制备 以狼毒叶片为外植体，通过添加不同浓度的萘乙酸(NAA)、6－苄氨基腺嘌呤(6－BA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、激动素(KT)、2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)等生长调节剂进行培养，诱导愈伤组织。将诱导出的愈伤组织于50℃条件下烘干、粉碎并称质量，用95%的乙醇(材料与乙醇比为1∶20)30℃条件下浸提3次，抽滤，风干，计算产率。

1.2.2 抑菌活性的测定

1.2.2.1 抑菌实验样品及对照品的配制 称取一定量的乙醇提取物，配制成为100.00 mg/mL的甲醇溶液，再分别以甲醇为溶剂配制成为5.00 mg/mL和10.00 mg/mL的溶液;配制5.00 mg/mL和10.00 mg/mL的青霉素钠溶液。

1.2.2.2 菌悬液的制备 将大肠杆菌、四叠球菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种培养(37℃摇床活化培养24 h)后，用无菌生理盐水稀释成含菌量为106～107CFU/mL的菌悬液备用。

1.2.2.3 抑菌圈法测定 将直径为0.6 cm的无菌滤纸片贴在已涂布0.2 mL菌悬液的培养基上，用移液枪在每个滤纸片上加入20μL不同浓度的甲醇样品溶液，37℃恒温培养24 h后测量抑菌圈直径。重复3次，取平均值。青霉素钠作为阳性对照。

1.2.3 样品的GC－MS分析

1.2.3.1 柱前衍生化 取一定量乙醇提取物于1.5 mL离心管，加入足量无水CaCl2，75℃放置1 h使提取物彻底干燥。每份样品加入250μL硅烷化试剂［双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)与吡啶比为5∶1］，75℃衍生化1.5 h。

1.2.3.2 测试条件 使用AGILENT 5975/6890N型气质联用仪测定提取物的化学组分。毛细管柱为 HP－35 ms(30.0 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，载 气 为 He，流 速 为1 mL/min，进样量为1μL，进样口温度为280℃。测定程序:柱温60℃，保持1 min;10℃/min升温至180℃，保持1 min;再以20℃/min升温至280℃，保持5 min。质谱条件:电子轰击源(EI)，电压70 eV，扫描范围20～800 u，根据质谱数据库NISTOS结合标准化合物，进行乙醇提取物主要成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同材料醇提物的产率

由表1可知，生长调节剂影响着醇提物的产率，30个愈伤组织样品中有25个产率高于MS培养基诱导的愈伤组织的产率，培养基中加入NAA 2.0 mg/L的样品21产率最高，为23.27%，加入 KT 2.0 mg/L的样品 25产率最低，为6.47%。研究结果表明。NAA 2.0 mg/L最有利于愈伤组织干物质积累。

表1 不同材料醇提物的产率

2.2 抑菌活性的测定

2.2.1 不同样品对大肠杆菌的抑制作用 对32个样品进行了抑菌活性分析，研究发现4、24、25、MS、W这5个样品对大肠杆菌的抑制效果好(表2)。其中W(野生狼毒根)各浓度抑菌效果最强，其最小抑菌浓度(MIC)为0.78 mg/mL;其次是样品25(添加KT 2.0 mg/L)与MS(无生长调节剂)，MIC均为12.50 mg/mL;样品 4(添加 NAA 1.0 mg/L+6 －BA 0.5 mg/L)和样品 24(添加 KT 1.0 mg/L)的 MIC 均为25.00 mg/mL，抑菌活性最差。

2.2.2 不同样品对四叠球菌的抑制作用 32个样品中8、10、28、MS、W这5个样品抑制四叠球菌效果较好。其中样品W(野生狼毒根)的MIC为3.13 mg/mL，抑菌效果最好;样品8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)的 MIC 为25.00 mg/mL;样品10(添加 NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)与样品28(添加2，4 －D 1.0 mg/L)的 MIC 均为12.50 mg/mL。样品MS(无生长调节剂)在浓度为6.25 mg/mL时，就具有抑菌活性，与野生根相差最小。

2.2.3 不同样品对金黄色葡萄球菌的抑制作用 通过研究发现，8、10、14、25、28、W 这 6 个样品抑制金黄色葡萄球菌效果较好。其中效果最好的为 W(野生狼毒根)，其 MIC为1.56 mg/mL;样品 10(添加 NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)与样品28(添加2，4 －D 1.0 mg/L)的MIC 均为6.25 mg/mL;样品 8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)、样品 14(添加TDZ 4.0 mg/L)和样品 25(添加 KT 2.0 mg/L)的 MIC 约为12.50 mg/mL;在较高浓度下，样品8、10、14 和28 的抑菌圈较大，抑菌效果随着浓度的降低显著下降。而W(野生狼毒根)的抑菌圈大小则是随浓度的减小有先增加后降低的趋势，说明野生狼毒根醇提物在一定浓度范围内表现出较强的抑菌活性。由表4可知，对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最好的为样品10和样品28。

表2 不同样品对大肠杆菌的抑菌作用

表3 不同样品对四叠球菌的抑制作用

表4 不同样品对金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.2.4 不同样品对枯草芽孢杆菌的抑制作用 在32个样品中，4、22、MS、W这4个样品抑制枯草芽孢杆菌效果较好。其中效果最好的为样品 W(野生狼毒根)，其 MIC为3.13 mg/mL;样品 MS 的 MIC 为 6.25 mg/mL;样品 4(添加NAA 1.0+6 －BA 0.5 mg/L)与样品22(添加 NAA 4.0 mg/L)的MIC分别为12.50 mg/L和25.00 mg/mL(表5)。

表5 不同样品对枯草芽孢杆菌的抑制作用

2.2.5 不同样品对白色葡萄球菌的抑制作用 研究表明，4、8、17、21、22、24、25、W 这 8 个样品抑制白色葡萄球菌效果较好。其中效果最好的为 W(野生狼毒根)，其 MIC为0.39 mg/mL;其次是样品25(添加 KT 2.0 mg/L)与样品8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)，其 MIC 均为3.13 mg/mL;样品4(添加 NAA 1.0 mg/L+6 －BA 0.5 mg/L)、样品21(添加 NAA 2.0 mg/L)和样品22(添加NAA 4.0 mg/L)的MIC 均为 6.25 mg/mL;样品 17(添加 6 －BA 2.0 mg/L)的 MIC 为12.50 mg/mL;样品24(添加 KT 1.0 mg/L)的抑菌效果最差，MIC 为25.00 mg/mL(表6)。

2.2.6 不同样品的GC－MS分析 如表7所示，多个样品含有短链的醇和酸，并且相对含量差异较大，如丁二酸在样品25中的相对含量为10.426%，但在样品4中则只有0.068%，说明添加KT 2.0 mg/L的培养基有利于狼毒愈伤组织产生丁二酸。在样品4、8、13及21中均检测到木脂素类化合物，其中样品 8的相对含量最高，为 9.740%，说明 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L培养基有利于木脂素的积累。

在样品 21、25、29及 W 中检测到甾醇类，添加 KT 2.0 mg/L的培养基中样品相对含量最高，为1.225%，高于W的含量(0.857%)。已有研究表明植物甾醇在降低血液胆甾醇含量、抑制肿瘤、防治前列腺肥大、抑制乳腺增生和调节免疫等方面都有重要作用［8］。葡萄籽油属于多酚类，是强抗氧化物质，对冠心病和骨质疏松症都有良好的预防作用。在所测样品中，只有样品25和W含有，而且在样品25中的相对含量为1.839%，高于样品W的含量(0.767%)。

表6 不同样品对白色葡萄球菌的抑制作用

表7 不同样品的化学成分及相对含量

另外，样品8中所检测到的成分多为氨基酸和醇类、酸类，说明添加NAA 0.5 mg/L与TDZ 2.0 mg/L的培养基较其他类型培养基更利于氨基酸的积累。样品4中检测到表儿茶素，表明添加NAA 1.0 mg/L与6－BA 0.5 mg/L的培养基更有利于黄酮类的积累。

3 结论

植物生长调节剂对愈伤组织醇提物的抑菌活性有很大影响。培养基中添加KT 2.0 mg/L所诱导的愈伤组织(样品25)对大肠杆菌的抑制效果好，培养基中添加NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L(样品10)和添加 2，4 －D 1.0 mg/L(样品 28)抑制四叠球菌和金黄色葡萄球菌效果较好，培养基中添加NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L(样品 8)和 KT 2.0 mg/L(样品25)抑制白色葡萄球菌效果较好，培养基中添加NAA 1.0 mg/L+6－BA 0.5 mg/L(样品4)抑制枯草芽孢杆菌效果较好。

植物生长调节剂对愈伤组织中化合物的合成与积累有一定的影响。NAA 0.5 mg/L与TDZ 2.0 mg/L有利于氨基酸和木脂素类化合物的积累。NAA 1.0 mg/L与6－BA 0.5 mg/L的培养基有利于黄酮类化合物的积累，KT 2.0 mg/L有利于甾醇类的积累。