毛细管电泳－电化学发光法分离检测麦芽中大麦芽碱

周 桂，谢贻冬，罗珍连，李美兰，贲蓓蓓，邓光辉

(1.广西民族大学海洋与生物技术学院/广西高校微生物与植物资源利用重点实验室，广西南宁530006;2.广西民族大学化学化工学院，广西南宁530006)

麦芽是1年生禾本科(Gramineae)植物大麦(Hordeum vulgare)的成熟果实经过干燥的炮制加工成品。将麦芽用于医药最早记载于南朝梁陶弘景的《别医名录》:“以作糵，温，消食和中”，至今已有1 000多年的历史［1］。唐朝苏敬的《新修本草》和明朝李时珍的《本草纲目》等古医书籍以及现代的《中国药典》中也记载了麦芽的相关药用功效，认为麦芽具有治疗脾虚、消胀、退乳等作用［2－5］。麦芽中所含的大麦芽碱(hordenine)化学名为4－(2－二甲胺基乙基)苯酚，具有收缩血管、兴奋中枢神经、松弛支气管平滑肌等作用［6－7］。随着对大麦芽碱研究的深入，其分析检测的方法主要有高效液相色谱法、薄层层析法、双电极液相色谱库仑检测、高效液相色谱－电喷雾质谱联用等［8－11］。目前还未见到有关毛细管电泳－电化学发光(CE－ECL)法分离检测大麦芽碱的报道。

毛细管电泳－电化学发光法是20世纪80年代开始发展起来的分离技术［12－16］，具有选择性高、效率高、分析速度快和易操作等优点［17－20］，因此在生物碱等化学物质的检测方面越来越受到重视［21－25］。本研究基于大麦芽碱能够增强Ru(电化学发光性号的特性，建立一种测定大麦芽碱的毛细管电泳－电化学发光新方法，并应用于麦芽中大麦芽碱的分离检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

麦芽由广西南宁市中药材市场提供，大麦芽碱标准品(含量≥98%)由北京索莱宝生物科技有限公司提供，并于笔者所在实验室－20℃冰箱保存。

磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠均为分析纯，由北京索莱宝生物科技有限公司提供。三联吡啶钌［Ru(bpy)3Cl2·H2O≥98%］，由梯希爱(上海)化成工业发展有限公司提供。

1.2 仪器与设备

MPI－A型毛细管电泳电化学发光检测仪(陕西西安瑞迈分析仪器有限责任公司);三电极体系由自制的碳纤维簇微盘电极(工作电极)、饱和甘汞电极(参比电极)、铂丝电极(辅助电极)组成;未涂层石英毛细管(50μm×50 cm，河北永年光导纤维厂);JY92－Ⅱ超声波细胞粉碎机(浙江宁波新芝生物科技股份有限公司);BSA124S－CW电子天平(Sartorius科学仪器北京有限公司);1810－B型自动双重水蒸馏器(江苏省金坛市医疗仪器厂)。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品和样品的制备 精确称量大麦芽碱0.10 g，用无水乙醇溶解并定容100 mL，在4℃条件下避光存放于棕色试剂瓶中，用时适当稀释。

将麦芽研磨成粉，并过60目筛后准确称取2.00 g于50 mL的具塞锥形瓶中，加入20 mL无水乙醇，100 W超声破碎处理30 min后浸提24 h，12 000 r/min离心25 min，取上清液。

1.3.2 毛细管电泳－电化学发光检测条件 在每次使用前，毛细管先分别用0.1 mol/L NaOH溶液和二次蒸馏水冲洗10 min，再用运行缓冲液冲洗20 min。铂电极用0.05μm的Al2O3粉末抛光平整并超声清洗干净，在显微镜下与毛细管对接。在ECL池中加入5 mmol/L Ru(bpy)32+和60 mmol/L PBS缓冲液(pH值 8.0)350μL，电泳分离缓冲液为10 mmol/L PBS(pH值6.15)。毛细管分离电压为13 kV，进样电压10 kV，光电倍增管高压800 V，进样时间10 s，以电化学发光信号的峰高定量。为了获得良好的重现性，减小由于溶剂蒸发等因素的影响，每3 h更换1次Ru(bpy)32+。所有进样溶液在进入毛细管前须用0.22μm微孔滤膜过滤。

2 结果与分析

2.1 检测条件的优化

2.1.1 检测电位的影响 工作电极上的检测电位是影响电化学发光强度的一个重要因素。控制其他条件不变，大麦芽碱的电化学发光强度随着电极电位从1.00～1.20 V的变化而变化(图 1)。在 1.00～1.16 V范围内，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)强度随着电极电位的增加而不断增加，当电极电位达到1.16 V时，发光强度达到最大。当电极电位超过1.16 V时，ECL强度随着电极电位的增加而下降，所以选择1.16 V为大麦芽碱的电化学发光最佳检测电位。

2.1.2 检测池中PBS浓度和pH值的影响 检测池PBS的浓度和pH值也是影响电化学发光强度的重要因素。控制PBS的pH值固定不变，检测其浓度30～70 mmol/L时，大麦芽碱电化学发光强度的变化。结果(图2)表明，PBS浓度在30～60 mmol/L时，电化学发光强度随着PBS浓度的增大而增大，当PBS浓度超过60 mmol/L时，电化学发光强度随着PBS浓度的增大反而减小，所以选60 mmol/L为PBS的最佳浓度。控制PBS的浓度为60 mmol/L不变，检测pH值在6.5～9.0范围内变化时，大麦芽碱电化学发光强度的变化。结果(图3)表明，在pH值6.5～8.0范围内，电化学发光强度随着pH值的增大而增大，当pH值超过8.0时，电化学发光强度随着pH值的增大而而减小，所以选择8.0为最佳pH值。

2.2 分离条件的优化

2.2.1 分离缓冲液的pH值和浓度的影响 分离缓冲液中的pH值会通过影响点渗流和样品的分离效率，从而影响样品的电化学发光强度。控制分离缓冲液的浓度不变，检测pH值从5.5变化到8.5过程中电化学发光强度的变化。结果(图5)表明，pH值在5.5～6.5之间时，电化学发光强度随着pH值的升高而升高，并在pH值为6.5时达到最大值，当pH值超过6.5时，电化学发光强度逐渐减弱，因此选择pH值6.5的缓冲液进行后续试验。同时，分离缓冲液的浓度也是影响电化学发光的一个因素。控制缓冲液的pH值为6.5不变，检测缓冲液浓度为5～30 mmol/L时的样品电化学发光强度。结果(图6)表明，当浓度为5～10 mmol/L时，ECL发光强度随缓冲液浓度的增加而增加，当缓冲液浓度超过10 mmol/L时，ECL发光强度开始下降，所以选择运行缓冲液浓度为10 mmol/L最佳。

2.2.2 分离电压和进样时间的影响 分离电压主要影响样品的迁移时间，分离电压越高，迁移时间越短。当分离电压在8～18 kV范围内变化时，综合考虑灵敏度、峰宽、噪音、分析时间及焦耳热等因素，选择13 kV作为分离电压较为合适。大麦芽碱采用电动进样，选择进样电压为12 kV，检测不同的进样时间对ECL发光强度、迁移时间和峰宽等的影响。在5～10 s的进样时间范围内，ECL发光强度随进样时间的增加而增加，但当进样时间超过10 s时，ECL发光强度基本不变，且峰变宽，所以考虑到进样时间对峰型的影响，选择10 s为最佳进样时间(图7)。

2.3 检出限、精密度和线性范围

配制一系列浓度的大麦芽碱标准品溶液，在已优化的条件下进行试验，每个浓度重复检测5次，以ECL发光强度(I)对大麦芽碱标准品含量(c，μg/L)绘制工作曲线，得到线性方程为 I=0.257 6c－ 429.81(r2=0.998 9)，线性范围为5 000.00 ～ 100 000.0 0 μg/L，检 出 限 (S/N=3) 为60.00μg/L。在此最优条件下对10 000.00μg/L麦芽碱进行5次分离检测，得到大麦芽碱的迁移时间和ECL发光强度相对标准差(RSD)分别为1.48%、2.69%，说明该方法的精密度良好。大麦芽碱标准溶液的毛细管电泳图见图8。

2.4 样品检测及回收率

图9为麦芽样品的CE－ECL发光图，测得麦芽中大麦芽碱的含量为(0.239±0.021)mg/g。样品加标回收试验结果见表1，电泳条件为:分离电压13 kV，分离缓冲液浓度10 mmol/L，pH 值 6.5，进样时间 10 s，检测电位 1.16 V，检测池 PBS 浓度 60 mmol/L，pH 值 8.0，Ru浓度5 mmol/L，加标的回收率在93.71% ～104.31%之间，相对标准差≤3.29%。

表1 麦芽中18 230μg/L麦芽碱加标回收率测定结果(n=5)

3 结论

采用毛细管电泳－电化学发光检测法分离并检测了麦芽中的大麦芽碱，得到最佳分离检测条件:分离电压13 kV，分离缓冲液浓度10 mmol/L，pH值 6.5，进样时间10 s，检测电为 1.16 V，检测池 PBS 浓度 60 mmol/L，pH 值 8.0，Ru浓度5 mmol/L。在此最优条件下检测到大麦芽碱的含量检测限(S/N=3)为60.00μg/L，麦芽中大麦芽碱的含量为(0.239 ±0.021)mg/g。加标回收率为 93.71% ～104.31%。相比较于高效液相色谱法和分光光度法，此方法具有操作简单、检测速度快、灵敏度高、重现性好、检出限低、少干扰、专属性强等优点，可为麦芽中大麦芽碱的检测鉴定提供依据，有望应用于麦芽或其他植物中的大麦芽碱含量检测和分析鉴定。