中华鳑鲏精子超低温冷冻保存

王 洲，王 权，刘美剑

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225000)

精子超低温冷冻保存技术能够长期保持种质资源、保证水产动物遗传物质的多样性。该技术已在多种鱼类精子保存中得到应用［1］，然而有关鳑鲏精子超低温冷冻保存技术研究较少［2］，中华鳑鲏精子冷冻保存技术方面还未有报道。本研究根据中华鳑鲏与日本鳑鲏生物学相近，参考日本鳑鲏精子超低温冷冻保存方法，选取在鱼类中运用比较广泛的二甲基亚砜作为冷冻保护剂［3］，探讨了3种不同浓度的DMSO、在不同的冷冻高度、特定高度下不同的保持时间对解冻后精子活力的影响。旨在筛选出一种可以用于中华鳑鲏精子冷冻保存方案，同时为后期进一步优化冷冻保存方案、长期保存中华鳑鲏优良种质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 鳑鲏与精子的收集 2016年4—5月从江苏泰州姜堰获得性成熟的中华鳑鲏个体，置于实验室水族箱(55 cm×30 cm×40 cm)内暂养1周。其间充氧并保持微流水，同时投喂优质饲料对鳑鲏进行营养强化，水温为18～20℃。取达到性成熟的鳑鲏个体［4－5］，采精时先用干毛巾将鳑鲏鱼擦干后，用指尖轻轻按压鳑鲏腹部，精液从生殖孔中流出，将精液收集到玻璃培养皿中。取少量精液用生理盐水(5%)激活后在显微镜下镜检，收集活力超过90%的精液样本。将来自不同亲本的3个精液样本混合，室温设定为20℃。

1.1.2 抗冻保护剂与人工精浆 二甲基亚砜(DMSO)具有快速渗透细胞膜的作用，作为冷冻保护剂已经在多种鱼类精子研究被证实具有较好的效果［6］。本研究选取3种不同的浓度(5%、10%、15%)的DMSO用于试验研究。为避免抗冻保护剂添加过程中对精子活力的潜在影响，精液在冷冻前一步加入到人工精浆(ASP)［2］－二甲基亚砜(DMSO)混合液中。ASP－DMSO混合液的配制按表1，试剂配好后用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值至8.0。所有试剂均为现用现配，室温存放时间不超过2 h。

表1 ASP－DMSO混合液配方

1.2 试验方法

1.2.1 精子激活后活力受时间的影响 为评估精子在水中存活时间，首先对精子动性进行评估，制定精子活力随时间延长的变化图。取收集好的精液0.1 mL，加2.0 mL生理盐水(5%)激活，显微镜下对精子动性进行观察，用血球计数板记录精子数，统计活力。

1.2.2 精子冷冻 将取自3个不同鳑鲏个体的精液收集好后混合，取0.1 mL精液与2.0 mL ASP－DMSO混合液混合，混合完成后移入0.5 mL的麦管(IMV，法国)，将麦管置于泡沫板上平放，后转入含有液氮的泡沫箱中保持数分钟，最终转入液氮中。泡沫板呈阶梯状，阶梯水平面距离液氮表面距离不同用以控制冷冻速率的快慢。为筛选出较优的鳑鲏冷冻保存方法，本研究对不同冷冻高度、液氮液面上不同保持时间进行筛选，以筛选出较优的冷冻方法。

1.2.2.1 不同冷冻高度对精子解冻后活力的影响 基于已发表的日本鳑鲏精子冷冻保存的研究［7］，本研究选取精子在加入ASP－DMSO混合液之后在液氮表面上方保持5 min，后转入液氮中。本试验设置了4种冷冻高度(麦管置于阶梯泡沫上水平放置，距离液氮表面高度分别为5、7、9、11 cm)，以设置不同梯度冷冻速率。

1.2.2.2 精液在液氮液面上保持不同时间的影响 根据以上试验结果，选取液氮液面以上5 cm作为精子冷冻高度，同时设置液氮液面上4种不同保持时间(4、5、6、7 min)，用以筛选出较优的保持时间。根据试验结果，选取液氮液面上方5 cm，每隔10 s记录该高度时的温度(Fluke，美国)，绘制温度－时间变化曲线图(图1)，用以给出试验时温度参数。

1.2.3 精子解冻 麦管在投入液氮中保存2 h后，用镊子小心地取出，立即置于20℃水中解冻20 s。取解冻后的混合液0.1 mL，用2.0 mL生理盐水稀释。后用血球计数板对解冻后精子活力进行计数，统计活力。

1.3 数据分析

试验数据采用“平均值±标准差”表示;数据分析使用SPSS23.0进行单因素方差分析;绘图使用Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 精子激活后活力受时间的影响

由图1可知，鳑鲏精子激活后动性在所选取各个时间节点处明显下降;精子在5 min内能保持较高的活力，5 min后活力明显下降，10 min后只有少量精子能存活，未发现有超过13 min的精子。

2.2 不同冷冻高度对精子解冻后活力的影响

由表2可知，液氮液面上方5 cm处冷冻后解冻精子效果较高，其中10%DMSO冷冻后解冻精子动性最高，15%DMSO次之，5%DMSO在此条件下未发现有解冻后精子游动的现象;其余高度在不同浓度DMSO中冷冻后解冻精子均未发现具有动性。

表2 精子在不同液面高度保持5 min后转入液氮冷冻后解冻精子活力

2.3 液氮液面上保持不同时间冷冻对解冻后精子活力的影响

由图3可知，液氮上方5 cm保持5 min时冷冻后解冻精子能够获得较高的动性，高于其他几组(4、6、7 min);5%DMSO保持4 min后冷冻后解冻观察到少量精子活动(3.19%)，10%DMSO在保持7 min后冷冻解冻后精子动性较低(1.15%)，其余多数在振动，未发现游动精子(图中横坐标上加粗部分表示解冻后精子动性为零试验组)。

3 讨论

精液超低温冷冻保存关键在于用一定浓度的抗冻保护剂充分渗透入精子内部、使之快速脱水;同时，尽量减少抗冻保护剂毒性对精子的影响。该试验中，中华鳑鲏在激活后精子保持较高动性(82.25%)时间相对较短(＜5 min)。考虑到后期抗冻保护剂在加入后DMSO的毒性问题，本试验在收集好精液后直接和ASP－DMSO混合物混合，以防止DMSO在逐步加入过程中局部浓度过大对精子造成损伤;同时减少精子暴露在抗冻保护剂中时间从而降低其毒性。

有别于部分鱼类精子玻璃化冷冻保存方案，该试验采用低速慢冻保存技术。有研究认为，精子冷冻保存在降温时细胞内外在成冰过程中有冷冻损伤、细胞质变化、细胞骨架等影响［8－10］，影响精子解冻活力。慢速冷冻有助于缓解冷冻过程中胞内外渗透压急剧变化带来的生理生化影响，从而提高解冻精子存活率。本试验在液氮上方5 cm保持5 min，该条件下冷冻速度为19～－75℃/min，后转入液氮，解冻精子动性高于其他组，该趋势与日本鳑鲏中的超低温冷冻结果相似(20 ～ －80 ℃ /min)［7］。

该试验方法可用于中华鳑鲏基因超低温冷冻保存，为进一步提高解冻后动性率，还须对抗冻保护剂毒性、冷冻速率、解冻方法进行优化。