喂食当归多糖对点带石斑鱼抗氧化酶活力及其基因表达的影响

刘 波，王庆奎，邢克智，陈成勋

(天津市水产生态与养殖重点实验室/天津农学院水产学院，天津300384)

点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)隶属鲈形目(Perciformes)科(Serranidae)，广泛分布于中国东南沿海。点带石斑鱼对环境适应性强、肉质鲜美，含有丰富的高不饱和脂肪酸，是一种低脂肪、高蛋白的上等食用鱼［1］，被中国港澳地区推为中国四大名鱼之一，素有“海鸡肉”之称。伴随着石斑鱼集约化养殖的兴起，石斑鱼健康水平下降，细菌性、病毒性疾病频发［2－3］。而常用的化学消毒剂和抗生素等药物，不仅导致病原微生物产生耐药性［4］，而且少量药物也残留在石斑鱼体内［5］，对人体健康有潜在的危害。

许多中草药多糖具有生物安全、可降解、环境友好等优点，能提高水产动物免疫力和抗病力，在水产养殖业中受到广泛关注［6］，抗氧化系统是非特异性免疫的重要组成部分，较强的抗氧化能力有助于机体免疫力的提高。研究发现，中草药多糖可通过调节抗氧化酶活性和相关抗氧化基因的表达，来提高对抗活性氧自由基的能力，饲料中添加牛膝多糖(Achyranthes bidentata)能提高草鱼(Grass carp)SOD、CAT活力，降低 MDA含量［7］。对拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)注射大黄多糖(Rheum palmatum L)后发现，过氧化氢酶、过氧化物还原酶、酚氧化酶原等免疫基因分别在血细胞和肝胰腺中明显上调，推测可能与拟穴青蟹免疫增强有关［8］。

当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是伞形科植物当归的主要活性成分之一［9］。研究发现，当归多糖能通过提高血液白细胞的吞噬能力和头肾白细胞的增殖能力，并促进点带石斑鱼的呼吸爆发活力、吞噬活力、降低迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)攻毒后试验鱼的累计死亡率来提高点带石斑鱼的非特异性免疫力和抗病力［10－11］。通过激活TLR22及其下游相关基因Toll样接头蛋白TRIF，干扰素调节因子IRF3主要组织相容性复合体(MHC)与肿瘤坏死因子(TNF－α)、白介素－8(IL－8)的方式调节石斑鱼的免疫功能［12］。改善抗氧化能力是多糖调节机体免疫力的机理之一［13］，通过体外试验证实当归多糖能够有效清除对生物体毒性强、危害大的超氧阴离子自由基和羟基自由基，抑制脂质过氧化［14］，但当归多糖对鱼类抗氧化能力方面的研究较少，本试验研究当归多糖对点带石斑鱼CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT抗氧化活力以及相关基因CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT mRNA的表达量的影响，为揭示当归多糖调节点带石斑鱼抗氧化能力的机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用点带石斑鱼(89.61±2.08)g由天津市海发珍品实业发展有限公司提供。当归购于天津市当地中草药市场，产地甘肃。本试验采用水提醇沉的方法［15］提取当归多糖(ASP)。

1.2 试验设计

选择健康且大小相近的点带石斑鱼450尾鱼随机分配到15个玻璃钢水槽(86 cm×62 cm×45.5 cm)，每个水槽30尾，将 ASP 按0、2 000、4 000、6 000、8 000 mg/kg 添加到基础饲料(表1)中，每种饲料喂食3槽试验鱼，连续投喂42 d后采样。每组每次采样12尾，取样前停食24 h，取样鱼用MS－222麻醉，用0.2 mL无菌注射器尾静脉取血，用8%肝素钠抗凝，收集血浆(4℃，4 000 r/min离心15 min);将采血后的试验鱼进行解剖，取肝胰脏，－80℃冰箱中保存。测定血浆和肝胰脏 CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT酶活力和 CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT基因表达量。

表1 试验饵料配方及其营养成分

表2 引物序列

1.3 试验条件和日常管理

试验水槽安置在石斑鱼室内工厂化养殖的水泥池中。试验用海水为石斑鱼循环水养殖用水，海水经生物包处理、充纯氧，紫外线消毒后，以0.3～0.8 m/s流速流入饲养水槽，过多的海水从出水管溢出，不再使用。试验期间水质条件为:水温26.5 ～27.8 ℃，盐度23% ～26%，溶氧量 8.24 ～8.52 mg/L，pH 值7.2 ～8.6，铵态氮(－N)含量0.009 ～0.011 mg/L，亚硝态氮(NO2－N)0.023～0.028 mg/L。每日 08:00 和16:00各投喂1次，每次饱食投喂，并避免产生残饵。

1.4 抗氧化指标

血浆及肝胰脏中的超氧化物歧化酶(CuZn－SOD和Mn－SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性采用南京建成生物研究所生产的试剂盒测定。

1.5 总RNA提取和cDNA的合成

用Trizol试剂(大连宝生物工程有限公司)提取肝胰脏中的总 RNA。用反转录试剂盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)合成cDNA第1条链，反应依据产品说明书进行。经测浓度后的样本按个人要求选择反转录的用量，10μL反应体系中保证总 RNA的量在500 ng以下。在200μL离心管中加入2μL 5×PrimeScript RT Master Mix和个人所需的RNA模板溶液，最后用ddH2O将溶液补齐至10μL。反应条件:37℃保温15 min，85℃保温5 s，然后置于4℃下保存备用。

1.6 肝胰脏 CuZn－SOD、Mn－SOD、CATm RNA表达水平测定

1.6.1 引物设计 根据GeneBank已上传的斜带石斑鱼的CAT序列(AY735009.1)、Mn － SOD 序列(AY735007.1)、CuZn－SOD序列(AY035854.1)和已上传的赤点石斑鱼的β－actin序列(HQ007251.1)，利用序列间的保守区域设计用于实时荧光定量PCR的引物(表2)，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.6.2 实时荧光定量 PCR 按照 SYBR Premix Dimer EraserTM(Perfect Real Time)试剂盒说明书操作。PCR扩增体系为20 μL，包括 10 μL SYBR Premix Dimer EraserTM、0.5 μL上游引物、0.5μL下游引物、2μL cDNA和 7μL ddH2O。

PCR反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性15 s，退火60 s，72 ℃延伸2 min，循环40 次。

1.7 数据统计

CuZn－SOD、Mn－SOD、CATm RNA的表达以β－actin为内参，参照对照组mRNA表达量，应用2－ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。数据采用用SPSS 13.0统计软件，作单因素方差分析，采用Duncan's法进行多重比较，p＜0.05表示差异显著。数据用“平均值±标准差”表示(n=3)。

2 试验结果与分析

2.1 提取的RNA质量

测定的D260nm/D280nm的比值在1.8～2.1之间，可以说明提取的RNA纯度较高，符合试验要求。琼脂糖凝胶电泳5S rRNA、18SrRNA、28SrRNA 3条条带清晰完整(图1)。

2.2 CuZn－SOD酶活力及基因

由图 2－A、图 2－B可知，喂食 42 d后，血浆8 000 mg/kg组与处理组差异不显著，其他组显著低于对照组;肝胰脏CuZn－SOD酶活力在6 000 mg/kg处理组显著高于对照组，其他组显著低于对照组。

由图2－C可知，喂食42 d后，随ASP添加量的升高，CuZn－SOD基因表达量先降低后升高再降低，6 000 mg/kg明显高于对照组，2 000、4 000 mg/kg明显低于对照组。

2.3 Mn－SOD酶活力以及基因

由图3－A、图3－B可知，喂食42 d后，随ASP添加量的升高，血浆处理组Mn－SOD酶活力先降低后升高再降低，2 000 mg/kg组明显低于对照组，其他组与对照组无显著差异;肝胰脏Mn－SOD酶活力先升高后降低再升高，各处理组均明显高于对照组，在2 000 mg/kg达到最大值。

由图3－C可知，喂食42 d后，Mn－SOD基因表达量在6 000 mg/kg明显大于对照组及其他组，在2 000、8 000 mg/kg明显低于对照组。

2.4 CAT抗氧化酶活力以及基因

由图4－A、图4－B可知，喂食42 d后，血浆CAT酶活力在8 000 mg/kg明显小于对照组，其他组与对照组差异不显著;肝胰脏中各处理组随ASP添加量的升高CAT酶活力先升高后降低，2 000、6 000 mg/kg处理组显著高于对照组，其他组与对照组差异不显著。

由图4－C可知，喂食42 d后，6 000 mg/kg组CAT基因表达量显著高于对照组，其他组与对照组差异不显著。

3 讨论

超氧化物歧化酶(SOD)作为活性氧清除剂参与清除体内自由基，与水生生物的免疫水平密切相关，对于增强整个机体的免疫功能具有重要作用［16］。研究发现，汪开毓等以鲫鱼(Crucain carp)为研究对象，投喂无花果(Ficus carica)多糖后可显著提高其血液SOD活性［17］;白东清等证实，长期投喂黄芪(Astraglusseu)多糖可显著黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)头肾和肌肉中 SOD酶活力［18］;李春震等对黑鲷(Sparus inacrocephalus)投喂不同浓度的人参多糖饲料后发现，人参多糖能显著提高黑鲷SOD基因表达量［19］。本试验中，随着ASP添加量的升高，肝胰脏CuZn－SOD酶活力及其基因表达量均呈现先降低后升高再降低的趋势，肝胰脏Mn－SOD酶活力呈现先升高后降低再升高，Mn－SOD基因表达量先降低后升高再降低，综合来看，添加量在6 000 mg/kg时肝胰脏CuZn－SOD、Mn－SOD酶活力和基因表达量明显高于对照组，这与高颖晖等报道的小鼠补充壳聚糖(chitosan)，能够增加力竭运动小鼠肝组织SOD酶活性和基因表达量活性的研究结果［20］一致，基因表达量可以提高其编码蛋白的表达量，从而提高相应酶活力［21］，当归多糖可通过上调CuZn－SOD、Mn－SOD基因表达来提高点带石斑鱼CuZn－SOD、Mn－SOD酶活力，促进机体免疫机制保护机体免受损伤。研究发现，ASP添加量在2 000、4 000 mg/kg时，血浆、肝胰脏 CuZn－SOD酶活力和基因表达量均明显小于对照组，推测是当归多糖浓度过低，无法达到对基因表达所需的浓度范围，对抗氧化系统的产生干扰，从而抑制了 CuZn－SOD基因的表达，使 CuZn－SOD mRNA转录水平降低，进而使CuZn－SOD蛋白合成减少，CuZn－SOD酶活力降低。

过氧化氢酶(CAT)是机体内不需要特殊供体而能够执行的第一道抗氧化防线任务的重要抗氧化酶。试验结果显示，喂食当归多糖6 000 mg/kg时能显著提高肝胰脏CAT酶活力和CAT表达量，与SOD结果一致，这可能与两者之间的功能有关，SOD和CAT是反映有机体抗氧化能力的2个重要指标，前者催化超氧化物歧化为过氧化氢，后者催化过氧化氢还原成水和氧，两者酶活力具有一定的同步性［22］，活性氧产生后，CAT活力量随SOD活力及其反应产物的增加而相应提高，将过氧化氢还原，从而降低组织过氧化损伤。类似地，血鹦鹉摄食牛膝(Achyranthes bidentata)多糖后，罗非鱼摄食黄芪多糖后，SOD和CAT活力也表现出一致性［23－24］。

综上所述，当归多糖能显著影响点带石斑鱼肝胰脏CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT酶活力，并且在 6 000 mg/kg显著上调CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT基因的表达量。

致谢:感谢天津农学院王晓梅教授、石洪玥实验师和天津市海发珍品实业有限公司在本试验石斑鱼养殖过程中提供的帮助，对此深表谢意!