连作对设施番茄土壤微生物及酶活性的影响

李兰君，刘玳含，刘建斌，武凤霞，朱英波

(1.河北科技师范学院生命科技学院，河北秦皇岛066600;2.北京市农林科学院植物营养与资源研究所，北京100097;3.北京城市学院城市建设学部，北京100083)

进入20世纪90年代，随着温室大棚、地膜覆盖等技术的发展，设施农业随之迅速发展［1］，设施蔬菜已经成为我国蔬菜生产的重要组成部分。近年来，由于人均耕地的减少、经济需要等原因，设施菜地的复种指数、集约化程度的增加使得设施菜地连作现象十分普遍。随着连作年限的增加，出现设施蔬菜产量降低、病虫害加剧等现象。连作障碍已经成为限制设施蔬菜高产、稳产的主要因素［2－3］。

长期连作破坏土壤稳定性，设施菜地中普遍存在土壤肥力下降、土壤次生盐渍化及土壤酸化［4－6］，严重影响植物对水肥的吸收利用，影响植物生长发育。吴道铭等对南方酸性红壤的研究表明，长期种植单一作物破坏土壤结构及土壤通透性，使土壤水盐失衡进而加剧土壤酸化及铝毒现象［7］。番茄连作的研究表明，连作使得土壤质量下降，土壤养分失衡，对土壤有机质、土壤全氮、速效钾、速效磷等都有很大影响［8－9］。土壤微生物是生态系统的重要一环，在土壤物质循环能量流动中具有不可替代的作用［10－11］。土壤微生物群落结构及土壤酶活性是土壤生态系统中最活跃的部分，能敏感地反映出土壤的质量和状态，是评价土壤环境的重要指标［12－13］。大量研究表明，土壤连作障碍与微生物的关系密切［14－16］。长期连作使土壤微生物生态环境失衡［17－18］。随着连作年限的增加，土壤细菌数量下降而土壤真菌数量上升［19］，真菌与细菌比值上升，土壤由肥力高的细菌型转变为肥力低的真菌型。Mazzola研究表明连作病害多来自真菌［20］。马宁宁等对设施番茄的研究表明，连作使土壤可培养微生物的种类下降，部分土著微生物灭绝［21］。马海燕等对非洲菊的研究表明，脲酶含量随连作年限的增加先增加后下降［22］。土壤中过氧化氢酶活性随番茄连坐年限增加缓慢增加而后逐渐下降，也有研究表明土壤过氧化氢酶活性随着连作年限的增加而上升［23］。本研究对北京市房山区的设施番茄连作土壤进行了理化指标、微生物指标和酶活性指标的综合分析，明确了不同指标的变化规律及指标之间的相关性，以期为设施连作土壤的改良提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年12月在北京市房山地区的设施蔬菜大棚选取番茄连作土壤作为试验土壤样品，共10个试验区，设施蔬菜的连作年限分别为 0、1、3、5、6、7、8、9、10、20 年。取得样品后当天带回实验室，一部分样品在于4℃保存，用于微生物测定;一部分土壤样品在阴凉处风干，捡出植物残体、石块及其他杂物。将风干后土壤样品碾碎，通过1 mm及0.25 mm筛子的土壤样品备用。

1.2 土壤理化性质的测定

土壤有机质含量测定采用K2Cr2O7氧化－外加热法，全氮含量测定采用凯氏定氮法，速效钾含量测定采用NH4OAc浸提－火焰光度法，有效磷含量测定采用NaHCO3浸提－钼锑抗比色法，电导率使用电导率仪测定，pH值使用pH仪测定，水 ∶土 =5 ∶1［24］。

1.3 微生物纯培养试验及DNA提取方法

土壤微生物数量采用稀释平板法测定，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养2～3 d后计数，真菌采用PDA培养基培养3～5 d后计数。

土壤细菌、真菌DNA分别使用细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、真菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取，细菌16S rDNA扩增，引物为27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和1492R(5'－TACGGCTACCTTCGACTT-3')，真菌ITSrDNA扩增，引物为ITS1(5'－TCCGTAGGTGAAGCGG－3')和ITS4(5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')［25］。扩增后的PCR产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司测序分析。

1.4 土壤酶活性测定方法

土壤过氧化氢酶活性采用KMnO4滴定法测定，以1 g土消耗的0.1 mol/L KMnO4的体积(mL)表示。土壤脲酶活性采用比色法测定，以3 h后1 g土含有的的量(mg)表示［25］。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0软件对数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 连作年限对设施番茄土壤理化性质的影响

研究发现，随着连作年限的增加，设施番茄土壤的全氮、速效钾、有效磷含量均逐渐增高然后下降，分别在连作7年、7年、6年达到最高值，比未连作土壤增加幅度分别达87.50%、751.93%、497.09%(表1)。其中土壤全氮含量在连作20年与未连作土壤相比差异不显著，其他连作年限全氮含量显著高于未连作土壤，土壤速效钾、有效磷含量皆显著高于未连作土壤。土壤有机质含量变化趋势与土壤的全氮、速效钾、有效磷含量变化趋势类似，在连作6年达到最高值，比未连作土壤增加幅度达到122.45%。由此可见，在连作过程中土壤有机质、全氮、速效钾、有效磷处于先积累后消耗的状态。

随着连作年限的增加，土壤pH值显著下降，在连作8年达到最低值，较未连作土壤下降了0.7，在连作20年土壤pH值有所恢复。随着连作年限的增加，土壤电导率先上升后下降，在连作5年达到最大值，较未连作土壤增加幅度达到8.34%，连作1年到连作6年与未连作土壤差异不显著，连作7年到连作20年土壤电导率显著低于未连作土壤。

2.2 连作年限对可培养土壤微生物的影响

2.2.1 连作年限对设施番茄土壤可培养土壤微生物数量的影响 研究发现，随着连作年限的增加，设施番茄土壤细菌数量呈先上升后下降趋势(图1)。在连作6年达到最高值，增加幅度为1 566.67%，连作8年后，细菌数量稳定，与未连作土壤差异不显著。真菌数量变化趋势类似于细菌变化趋势，在连作7年达到最高值，增加幅度为1 209.09%，连作6年与连作7年真菌数量差异不显著;连作9年后真菌数量趋于稳定，与未连作土壤差异不显著。设施番茄土壤微生物总量变化趋势类似于细菌、真菌变化趋势，随着连作年限的增加设施番茄土壤微生物总量呈先上升后下降趋势，在连作6年达到最高值(图2)。土壤中细菌数量最多，细菌是土壤可培养微生物的优势群体，但随着土壤连作年限增加，土壤细菌/真菌一直降低，在连作8年达到最低值，连作9年后土壤细菌/真菌开始上升，与连作8年土壤细菌/真菌差异显著，与未连作土壤差异不显著(图3)。

表1 连作年限对设施番茄土壤理化性质的影响

2.2.2 连作年限对设施番茄土壤可培养土壤微生物种类的影响 随着番茄连作年限增加，土壤可培养微生物的种类也发生了很大的变化(表2)。土壤可培养真菌的种类随连作年限的增加而缓慢减少，连作前6年真菌种类基本是不变的，连作7年后真菌种类开始减少。土壤可培养细菌种类连作前6年逐渐增加，其中连作3年开始出现微杆菌属(Microbacterium sp.)、溶杆菌属(Lysobacter sp.)(表 3)。连作 6、7、8、9、10 年均检测到寡养假单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)。连作7年后土壤可培养细菌种类开始减少，一些土壤细菌开始消失，其中连作1年出现的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，在连作10、20年都没有发现;地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)存在于连作3～8年，连作9、10、20年均未发现该菌。

表2 连作年限对设施番茄土壤可培养真菌种类的影响

2.3 连作年限对设施番茄土壤酶活性的影响

土壤酶广泛参与土壤中各种生物化学过程，其活性反应了土壤养分转化能力及土壤微生物的活性。其中过氧化氢酶参与土壤中各种化合物的氧化反应，并且能促进过氧化物的分解，避免其对植物的毒害作用。脲酶直接参与土壤中的氮循环，能在一定程度上反映土壤的供氮能力。随着连作年限的增加，设施番茄土壤过氧化氢酶活性先增加后下降，在连作6年达到最高值，增加幅度为19.18%，连作6、7年过氧化氢酶活性显著高于未连作土壤，连作20年过氧化氢酶活性显著低于未连作土壤，其他连作年限过氧化氢酶活性与未连作土壤差异不显著(图4)。随着连作年限的增加，设施番茄土壤脲酶活性先显著上升后显著下降，在连作5年达到最高值，增加幅度为27.03%，连作3、5、6年脲酶活性显著高于未连作土壤，连作7年后脲酶活性显著低于未连作土壤，连作9、10、20年之间脲酶活性差异不显著(图5)。

2.4 连作番茄土壤理化性质、酶活性、微生物数量相关性分析

研究发现，土壤脲酶活性与土壤电导率相关系数最大，为0.935(表4)。土壤过氧化氢酶活性与土壤全氮含量、有机质含量相关性较大，相关系数分别为0.804、0.828，说明土壤全氮含量、有机质含量较高时，土壤过氧化氢酶活性随之增加。土壤细菌数量、真菌数量与土壤有机质含量相关系数都较高，分别达到0.759、0.925，土壤有机质含量较高时，适于土壤真菌、细菌的生长。土壤有效磷含量与土壤真菌数量、细菌数量相关系数为0.753、0.659，土壤速效钾含量与土壤真菌数量、细菌数量相关系数为0.760、0.303。真菌数量和细菌数量均与有机质含量的相关性最大。

表3 连作年限对设施番茄土壤可培养细菌种类的影响

3 讨论与结论

长期连作条件下，土壤理化性质、土壤微生物总量、微生物多样性、土壤酶活性都会改变，从而影响作物生长发育，降低作物产量。土壤微生物是植物根际最活跃的部分，能敏感地反映出土壤生态系统的变化［12－13，26－27］。本试验结果表明，随连作年限增加，土壤细菌、真菌数量呈先增加后降低趋势，细菌与真菌比值则一直降低甚至连作7年后低于未连作土壤，土壤由细菌型向真菌型转变，这与前人研究结果［28－30］一致。此外，连作前期可培养真菌种类较为稳定，连作7年后可培养真菌种类减少，连作9、10年仅有2种可培养真菌。连作9、10、20 年均未发现木霉属(Trichoderma sp.)真菌，而目前发现的生防菌多为木霉属真菌，并且在此之前多属真菌渐渐消失。可培养细菌种类随连作年限先上升后下降，连作10仅有4种可培养细菌，连作7年后芽孢杆菌种类减少，连作3年后开始出现微杆菌，连作6年后开始出现寡养假单胞杆菌，芽孢杆菌被证实对植物生长有促进作用［31－32］，为根际有益微生物，其他多属细菌逐渐消失，总体细菌多样性减少。因此，长期连作使土壤环境趋向单一化，对土壤微生物进行定向选择，土壤有益菌减少，有害菌增加。

表4 连作番茄土壤理化性质与酶活性、微生物数量相关系数

土壤中酶来源于土壤微生物和根际分泌物，可以催化土壤中有机质的转化，其中过氧化氢酶可以分解腐殖质形成过程中产生的过氧化氢，减少其对植物的伤害，脲酶能促进土壤中有机氮向无机氮转化，提高土壤的供氮能力［26］。本试验结果表明，土壤过氧化氢酶活性随连作年限先增加后下降，总体变化不明显，仅有连作20年土壤过氧化氢酶活性低于未连作土壤。脲酶活性变化明显，连作前5年增加，之后开始迅速降低，连作7年低未连作土壤。

受温室大棚过量施肥、肥料利用率低及得不到雨水充分淋洗等条件影响，设施菜地土壤的有机质、全氮、速效钾、有效磷水平普遍较高［33－34］，且均高于露天土壤。本试验结果表明，连作前期土壤有机质、全氮、速效钾、有效磷水平随连作年限增加均升高，并且全氮与速效钾水平在连作7年到达最大值，有机质和速效磷水平在连作6年达到最大值，而后开始降低。pH值随连作年限增加不断降低，一直处于6.50～7.50间，土壤属于中性土。电导率先随连作年限的增加而升高，连作5年达到最大值，连作7年后降低幅度较大，与有机质、全氮、速效钾、有效磷变化趋势类似。但根据全国土壤养分分级标准(6级制)，设施番茄土壤各连作年限有机质含量都达到3级，其中连作6、7年达到1级;土壤全氮含量都达到3级，其中连作5、6、7、8年达到1级;土壤速效钾、有效磷含量都达到1级。说明设施番茄施肥量非常充足，甚至已经过量。

由番茄连作土壤理化性质、酶活性、微生物数量相关性分析得出，土壤脲酶活性与电导率相关极显著，土壤过氧化氢酶活性与土壤全氮含量、有机质含量相关性极显著。土壤真菌数量、细菌数量分别与土壤有机质含量相关极显著、显著。土壤脲酶活性受土壤电导率影响较大，土壤微生物数量受土壤有机质含量影响较大。

本试验结果表明，长期连作条件下，土壤细菌与真菌的比值一直下降，土壤由细菌型转向真菌型，连作前期土壤微生物多样性、酶活性、土壤养分均处于一个较高水平，土壤生态环境良好。连作6、7年后土壤微生物多样性降低，土壤微生物数量降低，酶活性减少，土壤养分减少，土壤质量下降，土壤生态环境转向恶劣，出现普遍的连作障碍问题。因此，在设施番茄生产中应尽量避免连作，对于长期连作的番茄产区可以通过与其他作物间作、调节pH值、合理施肥、施用微生物菌剂等方法防治连作障碍。