金刺梨黑斑病病原菌生物学特性及室内药剂毒力测定

张秀伟，蔡甫格，潘中涛，李用奇，鲍 菊

(贵州省安顺市农业科学院，贵州安顺561000)

金刺梨(Rosa sterilis var.)是贵州省特有的新兴果树，是刺梨的近缘种，属蔷薇科蔷薇属。2015年2月12日金刺梨通过植物新品种审定，定名为金果，是贵州省第1个植物新品种权，得到国家相关法律的保护。金刺梨果实富含维生素C、叶酸、胡萝卜素、超氧化物歧化酶、人体所需氨基酸等，同时还含有抗白血病的天门冬氨酸，是一种食药兼用的绿色保健食品，具有很高的商品价值与推广价值。但由于金刺梨是一种野生果树资源，驯化栽培历史短，果农对其病虫害不了解，在病虫害发生时盲目用药，不仅得不到有效防治，还提高了管理成本，造成很大的经济损失。“十二五”期间贵州省安顺市金刺梨的种植面积达1.3万hm2，随着种植面积的增加，金刺梨的病虫害也日益严重。因此，对金刺梨的病虫害进行相关研究，新确认2种病害，分别为黑斑病、褐斑病，其中黑斑病在局部区域发生，但病害一旦发生会直接导致金刺梨产量大幅度下降，黑斑病于金刺梨开花期发病，主要危害金刺梨幼嫩的果梗，初期在果枝上形成紫色不规则病斑，后期病斑连成片，形成黑色凹陷病斑，绕果枝一周，表皮干腐状，染病后期轻轻触碰果梗，整个花序全部脱落。采集黑斑病的病组织在室内保湿培养，发现有白色黏质团出现，证实该病主要由拟茎点霉属(Phomopsis Sacc.)真菌侵染引起，本研究对该菌的生物学特性进行初步探讨，并进行室内药剂筛选试验，以期为该病害的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

于2015年5月在贵州省安顺市农业科学院金刺梨种植基地采集金刺梨黑斑病病样，在贵州省安顺市农业科学院微生物实验室内进行病原菌的分离纯化，通过回接试验证明该菌为致病菌，经形态学和rDNA－ITS测序鉴定该菌为拟茎点霉属辣椒拟茎点霉真菌(P.capsici)，在PDA培养基(200 g马铃薯，20 g葡萄糖，18 g琼脂，1 000 mL蒸馏水)斜面上保存备用。

1.2 供试药剂

70%甲基硫菌灵可湿性粉剂，购自日本曹达株式会社;75%百菌清可湿性粉剂，购自英国先正达有限公司;80%多菌灵可湿性粉剂，购自南京卓创化工有限公司;58%甲霜·福美双可湿性粉剂，购自南京艾森精细化工有限公司;80%代森锰锌可湿性粉剂，购自浙江省东阳农药厂。

1.3 病原菌生长条件

1.3.1 不同温度对病原菌生长的影响 在无菌条件下，用直径为5 mm的打孔器打取在PDA培养基中培养7 d后的菌饼，菌饼要求生长一致，把菌饼接入PDA培养基平板中，分别放在 5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃恒温培养箱中培养，培养5 d后，用十字交叉法分别测量各处理的菌落直径，每个处理 3 次重复［1－2］。

1.3.2 不同pH值对病原菌生长的影响 用无菌NaOH溶液(1 mol/L)和HCl溶液(1 mol/L)将PDA培养基的pH值分别调至 3、4、5、6、7、8、9、10，将直径为 5 mm 的菌饼分别接入不同pH值的PDA培养基平板中，28℃恒温培养，每个处理重复3次，培养5 d后测量菌落直径。

1.3.3 不同培养基对病原菌生长的影响 将直径为5 mm的菌饼分别接入PDA培养基、胡萝卜培养基(100 g胡萝卜、18 g琼脂、1 000 mL蒸馏水)、燕麦培养基(20 g燕麦、18 g琼脂、1 000 mL蒸馏水)、植物培养基(20 g金刺梨嫩枝叶、18 g琼脂、1 000 mL蒸馏水)、水琼脂培养基(20 g琼脂、1 000 mL蒸馏水)、察氏培养基(3.00 g硝酸钠、1.00 g磷酸氢二钾、0.50 g 硫酸镁、0.50 g 氯化钠、0.01 g 硫酸亚铁、30.00 g 蔗糖、18.00 g琼脂、1 000.00 mL 蒸馏水)中，放入 28 ℃恒温培养箱中培养，每个处理重复3次，培养5 d后测量菌落直径。

1.3.4 不同碳源、氮源对病原菌生长的影响 以真菌生理培养基［3－4］(1.0 g 氮源、0.5 g 磷酸二氢钾、5.0 g 碳源、20.0 g琼脂、1 000.0 mL蒸馏水)为基础培养基，将直径为5 mm的菌饼接入不同碳源［果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、无碳源(CK)］、氮源［蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾、甘氨酸、无氮源(CK)］的培养基中恒温培养，每个处理重复3次，培养5 d后测量菌落直径。

1.3.5 不同光照对病原菌生长的影响 取直径为5 mm的菌饼，接入PDA培养基平板中，分别在连续光照(24 h光照)、间断光照(12 h光照，12 h黑暗)、连续黑暗(24 h黑暗)条件下，于28℃恒温培养，每个处理重复3次［5］，培养5 d后测量菌落直径。

1.3.6 菌丝、孢子致死温度的测定 分别在40、45、50、55、60℃恒温水浴锅的试管中加入1 mL用无菌水配制的孢子悬浮液;在加有2 mL无菌水的离心管中分别加入3块直径为5 mm的菌饼，处理10 min后，将其拿出冷却，分别接种在PDA培养基平板上，每个处理重复3次［6］，放入28℃恒温培养箱内培养，培养5 d后观察并记录菌丝、孢子的生长情况。

1.4 室内毒力测定

采用原药室内生长速率法［7－8］进行药剂筛选，测量5种供试药剂对金刺梨黑斑病病原菌毒力的大小。将供试药剂原药用无菌水配制成所需浓度，每种药剂设置5个浓度，取1 mL药液加入9 mL PDA培养基中，摇匀后倒入直径为8 cm的培养皿中，取出培养7 d的病原菌菌落，打取直径为5 mm的菌块，移入到加药的PDA平板培养基中，每种药剂每个浓度设置3次重复，以加入1 mL无菌水的PDA培养基平板为对照。培养5 d后测量菌落直径，计算抑菌率、各药剂的毒力回归方程、抑制中浓度(EC50)。抑菌率=［(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径］×100%。

2 结果与分析

2.1 不同温度对菌落生长的影响

由表1可知，金刺梨黑斑病病原菌在10～35℃均可生长，结合菌落浓密度得出该菌适宜的生长温度为20～30℃，在25～30℃条件下菌落生长较快，最佳生长温度为28℃，此时菌落直径达到9.33 cm，与其他温度相比差异显著(p＜0.05)，且菌落生长浓密。在温度低至5℃或高至40℃时菌落不能生长。

表1 不同温度对菌丝生长的影响

2.2 不同pH值对病原菌生长的影响

由表2可知，病原菌对pH值的适应范围较宽，pH值为3～10时均可生长，pH值为4～6时生长速度较快，pH值为4时生长速度最快，此时菌落直径达到4.58 cm，但菌丝较稀疏，pH值为5、6时生长速度次之，其菌落直径分别为3.57、3.22 cm，且菌丝生长浓密，pH值呈碱性后菌丝生长速度变慢。

表2 不同pH值对菌丝生长的影响

2.3 不同碳源、氮源对病原菌生长的影响

由表3可知，该菌在几类不同碳源培养基上均能生长，最适合菌丝生长的碳源为果糖，菌落直径达4.73 cm，菌落浓密，其次为蔗糖、麦芽糖，菌落直径分别为4.02、3.81 cm，且菌落浓密。在无碳源的情况下，该菌仍能生长，且生长速度较快，菌落直径达到4.43 cm，仅次于果糖，但其菌丝较稀疏。由表4可知，在不同氮源中，以蛋白胨为氮源时该菌生长得最好，菌落直径达到5.57 cm，且菌落浓密，其次为牛肉膏，菌落直径为5.02 cm，菌落浓密。在无氮源情况下该菌也可生长，菌落直径为3.57 cm，但菌落较稀疏。以甘氨酸为氮源时会抑制该菌生长。

表3 不同碳源对菌落生长的影响

表4 不同氮源对菌落生长的影响

2.4 不同培养基对病原菌生长的影响

由表5可知，病原菌在几种培养基中均能生长，该菌在PDA培养基上，菌落浓密，菌落直径达5.37 cm，与其他培养基相比差异显著(p＜0.05)，其次为胡萝卜培养基、察氏培养基，菌落直径分别为4.25、4.05 cm，但在察氏培养基上菌落较稀疏。该菌在水琼脂培养基上生长较缓慢，直径为2.27 cm，菌落较稀疏;在植物培养基上菌落直径为3.38 cm，菌落较稀疏。

2.5 不同光照对病原菌生长的影响

由表6可知，病原菌在连续光照下生长速度最快，菌落直径达到6.83 cm，与其他2种条件相比差异显著(p＜0.05)，但菌落较稀疏，间断光照与连续黑暗条件下的菌落直径差异不显著，菌落均较浓密。

2.6 菌丝、孢子的致死温度

经试验证实，病原菌菌丝的致死温度为55℃，孢子的致死温度为50℃。

表5 不同培养基对菌落生长的影响

表6 不同光照对菌落生长的影响

2.7 药剂筛选试验

对金刺梨黑斑病病原菌进行室内毒力测定，由表7、表8可知，几种杀菌剂中80%多菌灵可湿性粉剂对该菌丝的抑制效果最好，EC50为0.56 mg/L;其次为75%百菌清可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂，其 EC50分别为 2.51、4.61 mg/L;80%代森锰锌可湿性粉剂与58%甲霜·福美双可湿性粉剂对该菌菌丝的抑制效果较差，EC50分别为17.53、24.46 mg/L。

3 结论与讨论

金刺梨黑斑病病原菌生长温度较宽泛，在10～35℃均能生长，最佳生长温度为28℃，此时生长速度快且菌丝浓密;该菌喜欢弱酸环境，当pH值为4时生长速度最快，但菌丝较稀疏;对碳源要求不严格，在无碳源、多糖、单糖的情况下均能生长，以果糖为碳源时生长最好;在几种供试氮源中除甘氨酸不适合该菌生长外，其他几种氮源或无氮源条件下该菌均能生长，以蛋白胨为氮源时生长最好;金刺梨黑斑病病原菌对营养条件要求不严格，在6种培养基上均能生长，最适培养基为PDA培养基;不同光照条件对该菌的生长速度有一定的影响，连续光照比其他2种光照条件生长快，但菌丝较稀疏;同时本研究的结果证实，该菌菌丝的致死温度为55℃，孢子的致死温度为50℃。

表7 不同药剂对金刺梨黑斑病病原菌菌落生长的抑制效果

表8 不同杀菌剂对金刺梨黑斑病病原菌的毒力测定

目前，金刺梨黑斑病只是在局部区域发生，但危害较大，会直接导致金刺梨产量严重下降。本次试验结果表明，80%多菌灵可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂对金刺梨黑斑病病原菌的抑制效果较好，58%甲霜·福美双可湿性粉剂、80%代森锰锌可湿性粉剂的效果较差，由于本研究只做了室内药剂试验，还未进行室外大田试验，该结论有待进一步证实。