海洋放线菌A3202发酵液对柑橘绿霉病菌的抑制活性测定

鹿连明 蒲占湑 胡秀荣 杜丹超 黄振东 陈国庆

（浙江省柑橘研究所 台州318026）

目前对柑橘绿霉病的防治主要以化学药剂为主，如咪唑类杀菌剂咪鲜胺和抑霉唑、双胍盐类杀菌剂百可得等。化学农药的长期大量使用除带来环境污染、食品安全等问题外，还易诱发病原菌产生抗药性。研究表明柑橘绿霉病菌已对咪鲜胺等杀菌剂产生了普遍的抗药性[1]，其对柑橘绿霉病防治效果下降甚至失效的情况时有发生[2]。因此，筛选并使用新型柑橘防腐杀菌剂，对于柑橘的安全生产具有重要意义。微生物农药以其高效低毒、低残留、不易产生抗药性等特点越来越受到重视。目前已报道的对柑橘采后病原真菌具拮抗活性的微生物多以细菌和酵母菌为主，少数为陆地放线菌[3]，而利用海洋放线菌防治柑橘绿霉病方面的研究相对较少。

本实验室从浙江省玉环市海山潮间带采集的鳞笠藤壶中分离获得一株海洋放线菌，通过平板对峙法测定得知该菌株对柑橘绿霉病菌、柑橘炭疽病菌等多种植物病原菌均有较强的拮抗活性[4]。在此基础上，本研究进一步测定了该菌株的无菌发酵液对柑橘绿霉病菌的抑制活性，以期为将来开发相关的微生物药剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试海洋放线菌菌株A3202为本实验室从浙江省玉环市海山潮间带采集的鳞笠藤壶中分离获得；供试柑橘绿霉病菌为本实验室从柑橘果实中分离获得。

1.2 供试培养基

用于海洋放线菌菌株A3202活化的培养基为高氏一号固体培养基，购自山东拓普生物工程有限公司；用于菌株A3202发酵用培养基为黄豆粉培养液，配方为：黄豆粉20g、葡萄糖20g、硫酸铵5g、氯化钠8g、碳酸钙2g、蒸馏水1000mL；用于柑橘绿霉病菌培养的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，配方为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000mL。马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基，配方同PDA，不添加琼脂。

1.3 无菌发酵液的制备

以无菌接种环挑取高氏一号斜面培养基上保存的菌株A3202，于高氏一号固体培养基中划线后，置于28℃培养箱中培养6d。之后以无菌打孔器打取菌株A3202菌饼，接种至高压灭菌后的黄豆粉培养液中，于28℃恒温摇床中以转速180rpm/min震荡培养6d。之后将发酵产物于台式离心机12000rpm/min离心20min，除去菌丝体收集上清液，再将上清液经由无菌滤膜抽滤除菌，制得菌株A3202的无菌发酵液。

1.4 对菌丝生长的抑制活性测定

将制得的无菌发酵液与融化的PDA培养基混匀，然后倒入无菌培养皿中制成带药平板。以加纯培养基的PDA平板为对照。以无菌打孔器在预先培养的柑橘绿霉病菌菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼置于带药平板中央，于28℃微生物培养箱中恒温培养，每处理重复3次。用十字交叉法测量菌落直径，用下述公式计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100%。

1.5 对孢子萌发的抑制活性测定

刮取PDA 平板上的柑橘绿霉病菌，制得分生孢子悬浮液。加入适量菌株A3202的无菌发酵液并充分混匀，以不加粗提物的孢子悬浮液为对照。将其滴加到含有PDB培养基的无菌载玻片的中央，然后将玻片放于垫有滤纸的培养皿中的U型管上，以无菌水湿润滤纸，并置于28℃微生物培养箱中恒温培养，以上各处理均重复3次。培养一定时间后，在显微镜下计数400～600个孢子，以芽管长度超过孢子长度1/2为标准视为孢子萌发，统计孢子萌发个数并计算孢子萌发率。

1.6 对柑橘绿霉病的防效测定

将供试柑橘果实在无菌发酵液中浸泡后取出晾干，以无菌水浸泡处理的果实作为阴性对照，以咪鲜胺浸泡处理的果实作为阳性对照。将各处理的果实涂抹浓度为1×106个孢子/mL 的柑橘绿霉病菌孢子悬浮液。然后将处理过的果实放于保鲜盒中，置于28℃恒温培养箱中培养。统计柑橘果实发病情况，计算病情指数和相对防效。病情分级标准：0级：无病；1级：病斑占果表面积5%以下；3级：6%～10%；5级：11%～25%；7级：26%～50%；9级：51%以上。病情指数=Σ（各级烂果数×该级代表值）/（总数×最高级代表值）×100；相对防效=（对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数）×100%。

2 结果与分析

2.1 对菌丝生长的抑制活性

从试验结果（如图1）得知，在添加有菌株A3202无菌发酵液的PDA平板上，柑橘绿霉病菌的生长速度较慢，明显低于未添加无菌发酵液的PDA平板，且菌落上易形成皱褶，难以向四周扩展生长。测定菌株A3202无菌发酵液对柑橘绿霉病菌的菌丝生长抑制率可达66.82%，表现出较强的抑制柑橘绿霉菌菌丝生长的活性。

2.2 对孢子萌发的抑制活性

从试验结果（如图2）得知，菌株A3202无菌发酵液会明显抑制柑橘绿霉菌的分生孢子萌发。培养6h后，在添加有菌株A3202无菌发酵液的PDB培养基中，柑橘绿霉菌的分生孢子萌发率仅为26.32%，且芽管较短，很少见到生长成的菌丝；而在未添加无菌发酵液的PDB 培养基对照中，其分生孢子萌发率可高达75.63%，且有很多芽管继续生长成较长的菌丝。

2.3 对柑橘绿霉病的防效

从测定结果（表1）可知，菌株A3202无菌发酵液对柑橘绿霉病表现出一定的防效。在柑橘绿霉菌接种后培养10d，以无菌发酵液处理后的柑橘果实的病情指数为4.23，而未用无菌发酵液处理的对照的病情指数则为15.85，无菌发酵液对柑橘绿霉病的相对防效可高达73.41%。随着培养时间的延长，各处理的柑橘果实绿霉病的发病情况明显加重，在接种后20d，以无菌发酵液处理后的柑橘果实的病情指数增长为26.37，而未用无菌发酵液处理的对照的病情指数则升高为50.23，无菌发酵液对柑橘绿霉病的防效下降为47.20%，低于400mg/L的咪鲜胺的防效。

海洋放线菌菌株A3202

无菌发酵液对柑橘绿霉病的防效

表1

3 讨论

在利用海洋放线菌防治植物病害方面，人们开展了诸多有益的探索。如马桂珍等从海水、海泥和海洋动植物样品中筛选出一株对番茄早疫病菌等植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发有抑制作用的海洋放线菌[5]；蒲小明等从多个海洋放线菌菌株中筛选出一株对花生青枯病菌有较强拮抗作用的菌株，并鉴定其活性成分为放线菌素V[6]；方丽萍从海水、海泥样品中筛选出3株海洋放线菌，其发酵液对小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、苹果轮纹病菌等多种植物病原菌的菌丝生长和孢子萌发均有较强的抑制作用[7]。

菌株A3202为本实验室从海山潮间带采集的鳞笠藤壶中分离获得的一株海洋放线菌，测定得知其对多种植物病原菌具有较强的拮抗活性。本研究测定了其无菌发酵液对柑橘绿霉菌的抑菌活性，从研究结果可知，其对柑橘绿霉菌的菌丝生长和孢子萌发均具有显著的抑制作用，对柑橘绿霉病也表现出一定的防效，表现出较好的开发利用前景。因此，在此基础上，有必要通过优化发酵条件、诱变改良等手段提高菌株A3202的抑菌活性，分离提取其主要活性成分并测定其抑菌效果，进一步探索其在柑橘病害生物防治中的应用价值。