不同花色白芨四种DNA条形码的序列分析

曾丽娜 刘显义 石建龙

摘要：采用CTAB法提取2种花色白芨基因组DNA，选用trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3 4种植物DNA条形码通用引物进行PCR扩增，分析黄花、紫花白芨（Bletilla striata）4种DNA条形码的序列，扩增产物纯化后连接T载体并测序，用DNAMAN软件对测序结果进行多序列比对分析。再根据SNP位点设计引物，利用位点特异性PCR扩增进行鉴定。结果表明，4对植物DNA条形码通用引物均能进行扩增，其中trnH-psbA序列没有发现SNP位点、rbcL序列出现2个SNP位点、ITS序列出现62个SNP位点、LSU D1-D3序列出现3个SNP位点。根据LSU D1-D3序列上的2个SNP位点设计的引物DUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）和JDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′）能准确鉴定出黄花白芨，成功获得鉴定黄花白芨的引物序列。

关键词：白芨（Bletilla striata）；DNA条形码；PCR；SNP

中图分类号：R282 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）17-0106-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.027 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Genomic DNA was extracted from the two kinds of color of Bletilla striata by using the CTAB method. To analysis the sequence of different flower color of Bletilla striata based on the four kinds of DNA barcode for further identification. Four DNA barcoding markers（trnH-psbA，rbcL，ITS and LSU D1-D3） were selected for PCR. PCR product was ligated into T vector for sequencing. The sequencing results were analyzed by using DNAMAN software. According to the SNP loci of different color of Bletilla striata， the primers were designed for identifying different color of Bletilla striata. Result showed that：two kinds of flower color of Bletilla striata genomic DNA can be amplified based on 4 pairs primers of plant DNA barcode markers and SNP loci were found. None SNP locus was found in trnH-psbA sequence. Two SNP loci were found in rbcL sequence. Sixty-two SNP loci were found in ITS sequence. Three SNP loci were found in LSU D1-D3 sequence. Primer DUAN5（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′） and JDHH（5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′） can be used for identifying the yellow flower color of Bletilla striata according to the SNP loci in LSU D1-D3 sequence. The primers were found for identifying the yellow flower color of Bletilla striata.

Key words： Bletilla striata； DNA barcode； PCR； SNP

白芨（Bletilla striata）為兰科（Corchidaceae）白芨属（Bletilla）多年生草本植物，是中国重要的中药材。商品白芨为白芨属白芨假鳞茎制成的干燥块茎，性平味苦，具有敛气、渗痰、止血、消肿等功效，主要用于治疗咳血、吐血、外伤出血、溃疡病出血等。白芨属植物全世界共有6种，其中中国有4种，即华白芨（Bletilla sinensis）、小白芨（Bletilla formosana）、白芨（Bletilla striata）和黄花白芨（Bletilla ochracea）[1]。主要分布在贵州、广西、安徽、四川、云南、陕西和湖北等地，其中以贵州、广西、湖北、安徽野生种质资源分布最为丰富。

由于白芨种子发育不完全，常规条件下很难发芽。近年来，随着药理研究的深入，市场需求强劲增长，人们疯狂采挖野生资源，导致野生白芨资源急剧减少。为满足日益增长的市场需求，白芨组培快繁技术与直播技术相继研发成功[2-5]，全国各地掀起白芨人工种植热潮。但是，用于繁育种苗的白芨果荚均没有经过品种选育，而是采集于野生白芨资源。于是，在白芨种植基地中普遍出现黄花、白花、紫花白芨混杂的情况，大大影响药材安全。《中国药典》规定药用的主要为紫花三叉白芨，其他黄花、白花白芨等都是习用品和伪品。为此，迫切需要研发能在幼苗或种茎时对黄花、白花、紫花白芨进行快速鉴定的方法。

有关白芨属植物的鉴定，已有从形态学、化学成分以及ISSR、RAPD等DNA分子标记方面的报道[6-8]， 这些研究都为白芨属药用植物的鉴定提供了依据。DNA条形码的出现，为白芨属药用植物的鉴定带来了新的思路。DNA条形码技术（DNA barcode）是利用相对较短的标准DNA片段对物种进行快速、准确鉴定的一门技术。由加拿大分类学家Paul Hebert 在2003年首次提出，该技术可以从分子水平弥补传统鉴定方法的一些不足。DNA条形码技术优点：①具有不受生物个体形态特征限制，只需小部分材料就能准确鉴别大多数物种。②鉴定结果不受个体生长发育阶段影响，从而加快鉴定进程。③准确性高。一个好的DNA条形码应符合的条件：①在种内种间需要有明显的遗传变异和分化，同时种内变异足够小。②片段足够短，便于一个反应完成测序工作，而且便于DNA提取，满足PCR扩增，尤其是对存在DNA降解的材料。③存在保守区域，便于设计通用引物。DNA条形码技术具有较好的通用性，只需选用一个或少数几个基因片段就可快速有效地鉴别物种，而且该技术操作简便，具有较好的重复性和稳定性，目前已得到广泛的应用。2014年，基于ITS2+trnH-psbA片段组合的中药材DNA条形码鉴定系统已初步建成，它系统收录了中国药典以及日本药局方、韩国药典、美国药典、欧洲药典和印度药典所记载的23 262个物种（包含了95%以上的草药药材），共计78 847条DNA条形码序列[9]。中国医学科学院完成了8 000余种中草药白芨其混伪品的DNA条形码研究，创建了“中药材DNA条形码生物鉴定体系”。验证发现约220 bp的核基因組序列ITS2具有良好的鉴定效率，特别适合中药材等存在DNA降解的材料。该序列明显优于国际生命条形码联盟推荐的400～800 bp叶绿体序列rbcL和matK联合条形码。trnH-psbA、rbcL、matK、ITS、ITS2、LSU D1-D3 6种DNA条形码常用于药用植物的物种鉴定[10]。

2014年，吴劲松等[11]选用nrDNA ITS、LFY同源基因内含子2、叶绿体ycf1基因3种DNA条形码对白芨属药用植物进行了研究，研究结果表明，nrDNA ITS和ycf1序列可以作为白芨属及其混伪品鉴定用的DNA条形码。

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP），是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。本试验通过对黄花白芨、紫花白芨的trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3序列进行分析，并针对分析发现的SNP位点3′末端的碱基设计特异性扩增引物，优化PCR扩增体系，以期能准确鉴别黄花白芨和紫花白芨。

1 材料与方法

1.1 材料

采自贵州遵义市白芨种植基地的黄花白芨和紫花白芨，并经贵州医科大学生药学教研室龙庆德教授鉴定。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 各取黄花白芨、紫花白芨100 mg嫩叶，采用CTAB法提取其全基因组DNA。操作步骤参照《基因工程实验教程》中的植物组织基因组DNA的提取部分，略有改动。基因组DNA用TE溶液溶解后，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余保存于冰箱-20 ℃。

1.2.2 PCR扩增 选用文献[10]中trnH-psbA、rbcL、ITS、LSU D1-D3 DNA条形码的扩增引物进行PCR扩增，扩增引物见表1。使用梯度PCR仪摸索反应条件和扩增。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，荧光成像系统拍照保存。用回收试剂盒对特异目的条带进行回收纯化。

1.2.3 PCR产物连接T载体与测序 按照T载体使用说明将回收的目的片段与T载体进行连接，热击转化DH5α感受态细胞，依据蓝白斑筛选重组转化子。

1.2.4 重组转化子的鉴定 挑选白色菌落接种于3 mL LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min培养12～16 h。利用M13通用引物对菌液进行扩增，产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.5 测序、序列比对分析 将鉴定正确的重组转化子菌液送北京华大基因有限公司测序。用DNAMAN软件对测序结果进行拼接、序列比对，分析黄花、紫花白芨的序列差异。

1.2.6 SNP位点确认、引物设计及PCR验证 根据序列分析发现的SNP位点设计引物，设计主要依据3′端碱基要严格配对的原则。采用梯度PCR仪摸索扩增反应条件。利用该条件进行重复3次的PCR扩增，3次扩增结果一致，则认为该SNP位点真实存在，可用于鉴定。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA抽提

采用CTAB法分别抽提黄花白芨、紫花白芨基因组DNA。经紫外分光光度计进行检测，所提DNA吸光度值A260 nm/A280 nm比值均在1.8～2.0，无蛋白质等污染。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，所得条带清晰，无拖尾现象，可满足扩增要求。

2.2 4种DNA条形码通用引物的PCR扩增

根据梯度PCR预试验结果，确定4种DNA条形码扩增退火温度分别为ITS 47 ℃，LSU D1-D3 56 ℃，trnH-psbA为58 ℃，rbcL为55 ℃。4种DNA条形码扩增序列长度分别为ITS序列762 bp，LSU D1-D3序列760 bp，trnH-psbA序列约896 bp，rbcL序列598 bp，PCR扩增电泳检测结果如图2所示。4种DNA条形码均能扩增出相应大小的特异条带。

2.3 扩增产物与T载体连接、转化及重组子鉴定

将特异PCR产物进行回收，并与T载体进行连接，然后热击转化、涂板。培养过夜后，挑选白色菌落进行培养。选用T载体上的M13通用引物进行重组子的鉴定，其中rbcL重组子鉴定电泳结果见图3。第1、2、3泳道的M13引物PCR扩增产物大于第4泳道的rbcL通用引物扩增产物，显示连接成功。将鉴定连接好的重组子菌液送北京华大基因有限公司测序。

2.4 序列分析

用DNAMAN软件对测序结果作多序列比对分析，其中ITS序列总长762 bp，2种花色一致性91.87%，共有62个SNP位点，是4种DNA条形码序列中SNP位点最多的序列；LSU D1-D3序列总长760 bp，2种花色一致性99.61%，3个SNP位点。rbcL序列总长598 bp，2种花色一致性99.67%，2个SNP位点；trnH-psbAF序列总长896 bp，2种花色一致性100%，序列完全一致。具体见表2和表3。

2.5 SNP位点确认及鉴定

根据LSU D1-D3序列636和641位点SNP设计引物，上游引物为DUAN5：（5′-TAGTAACGGCGAGCGAAC-3′）；下游引物则根据3′端碱基要严格配对的原则进行设计，命名为JDHH，序列为5′-TTATCAGCTTCCTTGCGCCCG-3′。2个斜体G即为黄花白芨636和641位点的2个C，扩增产物大小约640 bp。利用梯度PCR仪摸索扩增条件，最佳退火温度为54 ℃。扩增体系为30 μL体系中6 μL 5×Taq buffer，dNTPs 2.4 μL，1 μL引物（终浓度0.4 μmol/L），1 μL模板（终浓度约60 ng），Taq酶0.15 μL，ddH2O加至30 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。分別利用该反应程序对紫花白芨、黄花白芨进行扩增鉴定，结果3次重复试验均获得一致结果，即只有黄花白芨有相应扩增条带，而紫花白芨没有扩增产物，结果如图4所示。表明这2个SNP位点真实存在，所设计的引物可用于鉴定黄花白芨。

3 讨论

ITS、trnH-psbA、rbcL、LSU D1-D3 DNA条形码已广泛应用于多种物种的鉴定中。本试验中，这4种DNA条形码对紫花、黄花2种花色白芨均能进行PCR扩增，连接T载体后的测序结果也均能找到上下游引物。其中ITS是核糖体DNA的非编码区，承受着较小的选择压力，因此ITS序列进化速度较快、变异较大，长度适中，常用于物种的鉴定[12]。黄花白芨、紫花白芨ITS序列分析结果也显示，相比其他3种DNA条形码，ITS序列差异最大，多达62个SNP位点。吴劲松等[11]的研究结果显示，核基因nrDNA ITS和叶绿体基因ycf1序列均可作为白芨属鉴定的有效DNA条形码，并采用单片段nrDNA ITS或ycf1基因序列就能成功鉴定出白芨属物种及其混伪品。

trnH-psbA序列是进化速率较快的叶绿体间隔区之一。trnH-psbA两端有75 bp的保守区序列，为设计通用引物提供了较大的便利[13]。从各类DNA条形码技术的报道和相关文献来看，ITS序列和trnH-psbA序列适合鉴别种级的不同个体[14]，但本试验结果却发现黄花白芨和紫花白芨的trnH-psbA序列完全一样，没有差异，值得深入研究，即trnH-psbA序列不适合用于鉴别黄花白芨、紫花白芨。

rbcL基因为叶绿体基因，编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的大亚基。由于叶绿体DNA序列和结构的高度保守性[15]，rbcL基因的差异小，PCR扩增容易，在植物种属鉴定中也得到了广泛应用。2009年国际条形码工作组提出matK+rbcL这两个序列作为通用的条形码序列[16]。黄花白芨与紫花白芨rbcL序列只存在2个SNP位点，且相距相对较远，不适宜设计引物进行鉴定。

核糖体大亚基（LSU）DNA（rDNA）含有12个扩增片段（D1-D12），为用作条形码提供选择[17]。28S rDNA D1-D3（LSU D1-D3）已被广泛用于鉴定药用植物。LSU D1-D3序列的通用引物在黄花白芨、紫花白芨中均能进行有效扩增，序列分析发现存在3个SNP位点，而且其中有2个SNP位点隔得很近，非常适合设计引物用于鉴定。PCR结果也证明该位点真实存在，通过PCR条带的有无就可鉴定黄花白芨和紫花白芨，出现条带的为黄花白芨，没有条带的为紫花白芨。

SNP位点的解析是分析种间差异小的种群的一个重要手段[18]。本研究通过对紫花白芨、黄花白芨 ITS、trnH-psbA、rbcL、LSU D1-D3 DNA条形码序列变异位点进行分析后，发现ITS、rbcL、LSU D1-D3 DNA条形码在紫花白芨和黄花白芨间存在稳定的SNP位点，这些位点的存在使2种花色白芨相互鉴别成为可能。为了进一步验证这些SNP位点的准确性，本研究就白芨药材（紫花白芨）和黄花白芨LSU D1-D3 DNA条形码序列的特异性位点设计引物，采用梯度PCR筛选最佳退火温度，优化扩增条件。通过凝胶电泳检测PCR扩增条带的有无，就可将白芨药材（紫花白芨）和黄花白芨进行鉴别。

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