黑米红枣乳酸菌发酵饮料品质分析

李璐琦，葛含静，兰永丽，李志西

( 1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100，2. 陕西学前师范学院， 西安 710100)

红枣(Ziziphusjujuba)是鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus)植物枣树的成熟果实。红枣营养价值高，含有丰富的糖类、有机酸、脂肪、氨基酸、多种维生素和矿质元素以及环磷酸腺苷、萜类化合物、黄酮类、酚类和膳食纤维等多种保健成分，性温味甘，具有补中益气、安中养脾、养血安神、保护肝脏以及增强人体免疫力等医疗保健功能[1]。黑米是特种稻米，营养丰富， 被认为是滋补佳品， 有“开胃益中， 健脾暖肝， 明目活血， 滑涩补精”等作用，历来深受东亚地区人民的喜爱。研究证实， 黑米所表现出的生理保健作用主要与黑米皮中富含的花色苷色素有关[2-3]。市面上红枣饮料和黑米饮料都有相关的产品，但有关黑米和红枣乳酸菌发酵饮料的研究鲜见报道。李君兰等[3]曾对发酵性黑米红枣饮料工艺进行初步研究，并未对饮料品质做详细分析。本研究拟结合黑米和红枣的感官优势和功能优势，利用益生菌微生态发酵技术研发新型黑米红枣乳酸菌发酵饮料，并对其风味及功能品质进行分析。以期为黑米和红枣资源高效利用及其乳酸饮料的研发与生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂及仪器

黑米：商品黑米，购自陕西杨凌好又多超市。

红枣：陕北佳县油枣，购自佳县木头峪镇王宁山村。

发酵制剂：试验所用菌种是一种微生态乳酸菌发酵剂，富含10多种乳酸菌，其中优势菌为干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，由西北农林科技大学发酵技术创新实验室培育和保藏[4]。

试剂：氯化钙、α-淀粉酶、糖化酶、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；没食子酸、芦丁、福林酚均购自美国Sigma公司。

仪器：PEN3便携式电子鼻系统，德国Airsense公司；Astree 型电子舌系统，法国Alpha公司；UV-1700型紫外分光光度计，日本岛津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、20 mL顶空样品瓶，美国Supelco公司；GC-MSQP2010联用仪，日本岛津公司；DB-17MS型色谱柱，美国Agilent公司；150A型恒温培养箱，江苏常州；H2050R高速冷冻离心机，湘仪离心仪器有限公司。

1.2 饮料制备

1.2.1 红枣乳酸发酵饮料(JLAF)的制备 工艺流程：红枣→清洗→蒸煮→破碎→乳酸发酵→分离过滤→调配→澄清→装罐→杀菌→成品。

操作要点：红枣蒸20 min后破碎，接种φ=4%菌种液，30 ℃发酵20 h后，制备红枣乳酸发酵饮料。

1.2.2 黑米红枣乳酸发酵饮料(BJLAF)的制备

液化与糖化：黑米粉与水按1∶8(质量比体积, g/mL)比例混合，置于自控温加热桶中，升温至65 ℃时添加占总量1/3的α-淀粉酶和氯化钙(0.2%)，不断搅拌，升温至90 ℃时添加其余2/3的α-淀粉酶(α-淀粉酶总量以8 U/g计)，保温10 min后，升温至100 ℃持续2 min酶灭活。然后降温至62 ℃加糖化酶，在60～62 ℃不断搅拌条件下保温4～6 h即得糖化醪。

原料处理与发酵：红枣蒸制20 min后破碎，按1∶8(质量比体积, g/mL)比例与黑米糖化醪混合，接种φ=4%菌种液，30 ℃发酵20 h后，制备黑米红枣乳酸发酵饮料。

1.3 测定项目

pH用pH计测定；可溶性固形物含量(TSS)用手持糖度计测定；酸度的测定采用NaOH滴定法。

总酚质量浓度采用福林酚比色法测定[4]，以没食子酸为标准物；黄酮质量浓度采用分光光度法测定[5]，以芦丁为标准物；DPPH自由基清除能力参考吴琼英等[6]的方法测定；ABTS自由基清除能力参考Re等[7]的方法测定。

色度值用CR-310手持色差仪测定[8]。色差仪测定的结果可以定量表示对色知觉的差异，L*值表示亮度，a*表示红值，a*为负数表示偏绿，b*表示黄值，b*为负数表示偏蓝。

电子鼻分析：量取10 mL样品置于30 mL样品瓶中，用瓶盖封住瓶口在室温下富集5 min后进行电子鼻分析，采用顶空进样法，直接将进样针头插入样品瓶，完成一次检测后系统进行清零和标准化，然后再进行第2次顶空采样，每组试验重复3次。预进样时间5 s，采样时间60 s，清洗时间300 s，内部流量300 mL/min，进样流量300 mL/min[9]。

电子舌分析：电子舌传感器阵列由7个交互敏感化学选择性区域效应味觉传感器和1个Ag/AgCl 参比电极组成。分析时，传感器阵列与样品溶液接触，传感器每秒采样1次，自动记录响应数据。每采样1次，传感器进入清洗溶液清洗1次，避免对下一个样品响应信号产生影响[10]。

SPME-GC-MS分析：准确移取5.0 mL样品置于20 mL顶空瓶中，加入0.75 g NaCl，然后用带有聚四氟乙烯隔垫的瓶盖密封。45 ℃平衡20 min，用已活化好的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取头顶空吸附50 min后，将萃取头插入GC进样口，解吸5 min。

色谱条件：DB-17MS毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃；升温程序：柱温40 ℃，保持3 min；4 ℃/min升至120 ℃；6 ℃/min 升至210 ℃，保持9 min；最终以25 ℃/min 升至240 ℃，保持3 min。

质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z为35～500。

1.4 数据处理

采用SPSS.V 20.0和Minitab 15对数据进行分析处理。电子鼻数据结合Winmuster进行分析，电子舌数据结合AlphaSoft.V 12.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸发酵饮料基础指标分析

由表1可知，与红枣乳酸发酵饮料相比，黑米红枣复配发酵饮料的酸度、可溶性固形物均有所增大，表明经黑米复配可有效改变红枣乳酸发酵饮料的糖酸水平及比例，使开发的新型黑米红枣乳酸饮料具有更加丰富的功能成分及风味特征。色泽是影响消费者对产品接受性最重要的因素之一。黑米红枣乳酸饮料的a*值(27.15)极显著高于红枣乳酸饮料(1.34)，表明黑米红枣乳酸饮料的红色度更高；同时黑米红枣乳酸饮料的b*值显著低于红枣乳酸饮料，说明前者的黄色度较低。这表明黑米与红枣复合发酵大大增加了红枣乳酸饮料的红色色调。而黑米红枣乳酸饮料的L*值显著低于红枣乳酸饮料，这是由于黑米的加入使得饮料的颜色更饱满。综合而言，黑米红枣乳酸饮料在色泽上优于红枣乳酸饮料。

表1 乳酸发酵饮料的基础理化指标Table 1 Basic physicochemical indexes of lactic acid fermentation beverages

注： 字母a、b表示在a=0.05水平上差异显著；字母A、B表示在a=0.01水平上差异显著。

Notes:Letter a, b in the columns of chromatic values indicate significant difference at the level ofa=0.05,letter A,B indicate significant difference at the level ofa=0.01.

2.2 乳酸发酵饮料抗氧化品质分析

酚类化合物不仅影响产品的颜色、收敛性和香味等感官特性[11]，也是乳酸发酵饮料抗氧化功效最重要的来源之一。2种乳酸饮料的总酚、黄酮质量浓度及抗氧化特性如表2所示。由表2可以看出，黑米红枣乳酸饮料的总酚、黄酮质量浓度显著高于红枣乳酸饮料(P<0.05)。黑米红枣乳酸饮料的总酚质量浓度为(107.56±1.84 mg/100 mL)，红枣乳酸饮料的总酚质量浓度为(86.46±3.28 mg/100 mL)。表明黑米的加入显著增加红枣乳酸饮料的总酚和黄酮质量浓度，二者复合发酵使得红枣乳酸饮料的功能及感官特性更加丰富。样品抗氧化活性的高低与多酚和黄酮类化合物含量有关[12]。黑米红枣乳酸饮料的DPPH和ABTS自由基清除率显著(P<0.05)高于红枣乳酸饮料。因此黑米红枣乳酸饮料的保健功能性明显高于红枣乳酸饮料。与干燥红枣片及果汁牛奶复合饮料相比[13-14]，黑米红枣乳酸饮料也具有较强的功能特性。

2.3 乳酸发酵饮料风味品质分析

2.3.1 电子鼻分析 电子鼻是一个新颖的分析、识别和检测复杂嗅味和挥发性成分的传感器阵列形式的电化学传感系统[15]。电子鼻对2种饮料成品芳香特征的响应及数据分析如图1。图1中每一条曲线代表着一个传感器，曲线上的点代表着样品的芳香成分通过传感器通道时，相对电阻率(G/G0)随检测时间的变化情况。由图1可知，2种饮料的变化趋势相似，各传感器响应值在0～10 s内比较低，随挥发物在传感器表面富集不断增大，20 s后趋于平缓，达到一个稳定的状态。其中，传感器W5S(氮氧化物)、W1W(硫化物)、W1S(甲基类)和W2S(醇类)较其他传感器有更高的相对电阻率值，黑米红枣乳酸饮料的相对电阻率值显著高于红枣乳酸饮料。结果表明电子鼻对黑米红枣和红枣乳酸饮料的芳香气味有明显的响应，且每个传感器的响应各不相同，黑米的加入使得氮氧化物和硫化物响应强度显著增加。黑米红枣复配体系相比单一红枣具有更为丰富的化学组成，含有的多种氨基酸、蛋白质、生物硫醇、有机酸和多酚等在微生态菌种的发酵代谢作用下产生了更多的氮氧化物、硫化物等组分，它们对黑米红枣饮料的风味形成具有重要意义。

表2 乳酸发酵饮料的总酚、黄酮及抗氧化特性Table 2 Total phenols, flavonoid and antioxidant properties of lactic acid fermention beverages

W1C.芳香苯类 Aromatic benzenes；W5S.氮氧化物 Nitrous oxides；W3C.芳香胺类 Aromatic amines；W6S.氢化物 Hydride；W5C.烷烃 Alkane；W1S.甲基类 Methyl class；W1W.硫化物 Sulfide；W2S.醇类 Alcohols；W2W.硫化氢类 Hydrogen sulfides；W3S.芳香烷烃 Aromatic alkane

图1电子鼻响应信号图
Fig.1Responsecurvesofe-nose

主成分分析(PCA)是一种设法将原来指标重新组合成一组新的互相无关的几个综合指标来代替原来指标，同时根据实际需要可从中去除几个较少的综合指标，以尽可能多地反映原来指标，通过改变坐标轴来达到区分样品的分析方法[16]。为进一步比较分析黑米红枣乳酸发酵饮料与红枣乳酸饮料整体风味差异，采用PCA法对这些气味数据进行数理统计。由图2可知，第1主成分PC1贡献率为99.60%(第1主成分：苯类、氮氧化物、硫化物、芳香胺类等；第2主成分：氢化物、芳香烷烃)，PC1和PC2贡献率之和达到99.90%，能很好地反映原始高维矩阵数据的信息，说明黑米红枣乳酸发酵饮料和红枣乳酸发酵饮料风味具有明显差别，利用黑米复配是改进红枣感官特性的有效方法[17-18]。

2.3.2 电子舌分析 电子舌7个传感器都对酸味呈味物质特别敏感，ZZ、BB、CA 3个传感器对甜味呈味物质尤其敏感。图3为电子舌传感器对黑米红枣乳酸发酵饮料和红枣乳酸发酵饮料成品的特征响应曲线。由图3可知，黑米红枣乳酸发酵饮料的电子舌响应曲线与红枣乳酸发酵饮料的特征响应曲线类似，但各传感器响应值的大小有所不同。其响应信号在第30秒后逐渐趋于平衡，在第120秒时达到稳态值。其中，传感器JE、BB对2种饮料的响应值差异不大，传感器HA、ZZ和GA对黑米红枣乳酸发酵饮料的响应信号显著高于红枣乳酸发酵饮料，这与基础指标结果一致，表明黑米红枣乳酸发酵饮料的糖酸水平更高、滋味更丰富。

图2 饮料电子鼻检测的PCA图Fig.2 PCA charts of beverages by e-nose

以各传感器第120秒的响应信号为变量，进行主成分分析(图4)。在PCA中第1主成分和第2主成分的贡献率分别达到96.72%和2.87%，能够很好地反映原始数据信息。表明主成分分析能将2种饮料样品很好地区分开来，虽然每组样品数据均有1～3个点距该组中心点较远，这主要是因为电子舌传感器在检测样品时，存在一个学习和适应新样品滋味的过程，一般前1～3 个数据点存在较大的偏差，但并不影响试验结果。

1.HA; 2.ZZ; 3.GA; 4.BB;5.JE; 6.JB; 7.CA

2.3.3 挥发性风味物质分析 挥发性化合物是影响饮料风味质量的重要因素。图5为黑米红枣乳酸发酵饮料和红枣乳酸发酵饮料成品中挥发性风味成分的GC-MS总离子流图。GC-MS检测得到的质谱数据经计算机NIST标准谱库检索后，鉴定出的各峰保留时间及对应的风味物质、相对含量见表3。

由图5可知，2种饮料的风味成分差异较大，黑米红枣乳酸发酵饮料的风味成分较红枣乳酸发酵饮料的更复杂，而红枣乳酸发酵饮料的主要风味成分较集中。从表3可知，在黑米红枣乳酸发酵饮料中鉴定出40种主要的风味成分，主要包括9种醛类、4种酮类、9种醇类、7种酯类、3种酸类和5种烃类化合物，其中相对含量较高的化合物分别是乙醇(16.7%)、3-甲基-1-丁醇(12.3%)、乙酸(10.09%)、2-甲基-1-丁醇(6.34%)、4-甲基苯甲酸环戊酯(5.77%)、乙酸乙酯(3.54%)、壬醛(3.85%)、己醛(3.38%)等化合物。在红枣乳酸发酵饮料中鉴定出39种主要的风味成分，主要包括7种醛类、2种酮类、7种醇类、12种酯类、5种酸类和2种烃类化合物，其中相对含量较高的化合物分别是乙醇(36.42%)、3-甲基-1-丁醇(24.12%)、苯乙醇(13.18%)、乙酸乙酯(6.59%)、辛酸(2.44%)等化合物。而乙醇、3-甲基-1-丁醇和乙酸乙酯是2种饮料共同的主要挥发性物质。

图4 饮料电子舌检测的PCA图Fig.4 PCA charts of beverages by e-tongue

图5 饮料挥发性成分总离子流色谱图Fig.5 Total ion current chromatogram of the volatile components of beverages

类别CategoryBJLAF风味成分Flavuor component相对含量/%Relative contentJLAF风味成分Flavuor component相对含量/%Relative content醛类乙醛Acetaldehyde0.53庚醛Heptanal0.08Aldehydes2-甲基-丙醛Propanal, 2-methyl-0.69呋喃甲醛Furfural0.66己醛Hexanal3.382,5-二羟基苯甲醛2,5-Dihydroxybenzaldehyde0.33庚醛Heptanal0.71辛醛Octanal0.58呋喃甲醛Furfural2.43苯甲醛Benzaldehyde0.27(Z)-2-庚烯醛(Z)-2-Hptenal2.50壬醛Nonanal1.88辛醛Octanal1.77苯乙醛Benzeneacetaldehyde0.22壬醛Nonanal3.85(E)-2-癸烯醛(E)-2-Decanal1.58酮类2,3-丁二酮2,3-Butanedione3.22(E)-3-戊烯-2-酮(E)-3-Penten-2-one0.16Ketones2-庚酮2-Heptanone0.35(E)-1-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮(E)- 1-(2,6,6-Trimethyl-1,3-cyclohexadien-1-yl)- 2-buten-1-one 0.351-辛烯-3-酮1-Octen-3-one1.67二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃2(3H)-Furanone, dihydro-5-pentyl-0.31醇类乙醇Ethanol16.70二甲基硅烷双醇Dimethyl-silanediol0.73Alcohols3-甲基-1-丁醇3-Methyl-1-butanol12.30乙醇Ethanol36.422-甲基-1-丁醇2-Methyl-1-butanol6.343-甲基-1-丁醇3-Methyl-1-butanol24.12二甲基硅烷双醇Dimethyl-silanediol4.362,3-丁二醇2,3-Butanediol0.531-己醇1-Hexanol0.561-辛醇1-Octanol0.151-辛烯-3-醇1-Octen-3-ol1.09芳樟醇Linalool0.101-辛醇1-Octanol0.29苯乙醇Phenylethyl alcohol13.18(E)-2-辛醇(E)-1-Octanol1.31苯乙醇Phenylethyl alcohol1.56酯类乙酸乙酯Ethyl acetate3.54乙酸乙酯Ethyl acetate6.59Esters4-甲基苯甲酸环戊基酯4-Ethylbenzoic acid, cyclopentyl ester5.77丙酸-2-羟基-乙酯Propanoic acid, 2-hydroxy-, ethyl ester0.14己酸乙酯Hexanoic acid, ethyl ester0.46丁酸-3-甲基-乙酯Butanoic acid, 3-methyl-, ethyl es-ter0.35辛酸乙酯Octanoic acid, ethyl ester0.99乙酸异戊酯1-Butanol, 3-methyl-, acetate0.63癸酸乙酯Decanoic acid, ethyl ester0.654-甲基苯甲酸环戊基酯4-Ethylbenzoic acid, cyclopen-tyl ester2.611,2-苯二甲酸双(2-甲基丙基)酯1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) ester0.47乳酸异戊酯Isoamyl lactate0.08邻苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate0.37二十二烷酸甲酯Docosanoic acid, ethyl ester0.14辛酸乙酯Octanoic acid, ethyl ester0.88琥珀酸-2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-十二氟庚基乙基酯Succinic acid, 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-dodecaflu-oroheptyl ethyl ester0.76己酸-2-苯基乙基酯Hexanoic acid, 2-phenylethyl ester0.65癸酸乙酯Decanoic acid, ethyl ester0.73苯丙酸乙酯Benzenepropanoic acid, ethyl ester0.25酸类乙酸Acetic acid10.09乙酸Acetic acid0.62Acids己酸Hexanoic acid2.53己酸Hexanoic acid0.85辛酸Octanoic acid0.67辛酸Octanoic acid2.44甲基2-羟基硬脂酸Methyl 2-hydroxystearate0.19壬酸Nonanoic acid0.63烃类辛烷Octane0.69顺式-1,3-二甲基 -环己烷Cyclohexane, 1,3-dimeth-yl-, cis-0.07Alkanes十四烷Tetradecane0.57十四烷Tetradecane0.26十六烷Hexadecane0.814-甲基-十四烷4-Methyl-tetradecane0.313-甲基-十四烷3-Methyl-tetradecane0.24其他二氧化碳Carbon dioxide2.73二氧化碳Carbon dioxide0.62Others2-肼基-4,6-二甲基嘧啶2-Hydrazino-4,6-dim-ethylpyrimidine1.14(1,4-二甲基戊-2-烯基)苯(1,4-Dimethylpent-2-enyl)benzene0.285α-胆甾烷-2-酮,肟5α-Cholestan-2-one, oxime0.475α-胆甾烷-2-酮,肟5α-Cholestan-2-one, oxime0.302-(甲氧基甲基)-2-苯基 -1,3-二氧戊环1,3-Dioxolane, 2-(methoxymethyl)-2-phenyl-0.17

黑米红枣乳酸饮料中醇类和醛类组分是主要的香气成分，相对含量分别为44.51%和17.44%。这些成分有的气味浓郁，有的气味清淡，有的呈现花香，有的呈现青草香，只有把它们作为整体时，才具有黑米红枣乳酸饮料的芳香特征。红枣乳酸饮料中醇类和酯类组分是主要的香气成分，相对含量分别为75.23%和13.81%。这些醇类主要由发酵过程中产生，都是呈香物质，其中苯乙醇具有怡人的玫瑰香和风信子香味[19]，芳樟醇呈花香味。酯类对果蔬发酵饮料风味具有重要影响，尤其乙酸乙酯具有果香味，能够使风味更加丰富[20]。壬醛和呋喃甲醛是2种饮料中共有重要风味成分，壬醛有橙子香味，呋喃甲醛赋予饮料杏仁和焦烤气味[21]。

3 结 论

该研究利用微生态乳酸发酵生物技术开发黑米和红枣复合乳酸发酵饮料，通过电子鼻、电子舌和SPME-GC-MS技术，对黑米红枣乳酸饮料的品质进行系统研究。黑米红枣乳酸饮料相比单一红枣乳酸饮料其酸度、可溶性固形物含量、抗氧化品质等指标均有增加，色泽更为鲜亮、饱满，这可能是源于黑米中丰富的多酚类物质。电子鼻和电子舌传感器对黑米红枣乳酸饮料响应值总体上大于红枣乳酸饮料，2种饮料在气味和滋味上具有明显差异，能被很好地区分。采用SPME-GC-MS联用确定饮料中主要的挥发性化合物，包括醛类、酮类、醇类、酯类、酸类及烃类等。黑米红枣乳酸饮料中的主要香气成分是醇类和醛类组分，其中相对含量较高的化合物分别是乙醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸、2-甲基-1-丁醇、4-甲基苯甲酸环戊酯、乙酸乙酯、壬醛、己醛等化合物，与红枣乳酸饮料(主要为乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸等化合物)相比前者的风味物质更为丰富，这可能是由于复配发酵使得更多复杂的风味物质产生。该研究结果可为营养健康型黑米红枣乳酸发酵饮料的开发提供一定理论依据和技术支持，同时也可为红枣资源转化及黑米、红枣系列产品的开发提供参考。后期研究应集中于2种饮料的其他功能特性、产品稳定性以及具体的功能性物质分析。