外源H2S缓解黄瓜种子萌发过程中干旱胁迫伤害的生理机制

牟雪姣，张远兵，吴 燕，张 强

(安徽科技学院 建筑学院，安徽蚌埠 233100)

黄瓜(CucumissativusL.) 是世界各国普遍栽培的重要蔬菜作物之一，其消费量大，种植面积逐年增加。黄瓜属浅根性作物，不同生育时期需水量都很高，发芽期要求更高，水分不足则发芽缓慢，整齐度差。干旱是黄瓜育苗阶段存在的主要问题，也是影响黄瓜产量的重要因素之一[1-2]。因此，探索外源物质对黄瓜干旱胁迫的缓解作用，提高黄瓜对干旱胁迫的适应性已成为黄瓜生产栽培中亟待解决的重要问题之一。

硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是继一氧化氮(Nitric oxide，NO)和一氧化碳(Carbon monoxide, CO)之后的第3种气体信号分子，广泛分布于生物体内[3]。H2S在植物的正常生理和逆境胁迫中均发挥着非常重要的作用，能够显著提高植物对非生物胁迫的抗性[4]。近年来，关于外源H2S提高植物抗旱性的研究已经取得一定进展。有研究表明，H2S可以通过上调超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶的活性来降低甘薯幼苗中H2O2的水平，进而提高其抗旱性[5]；也可以通过调控谷胱甘肽和抗坏血酸代谢来减缓干旱胁迫对小麦幼苗造成的氧化伤害[6]；H2S还可以诱导干旱胁迫条件下蚕豆和凤仙花植株叶片的气孔关闭，减少水分蒸腾，以缓解干旱胁迫[7]。此外，外源H2S还能够通过提高最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭系数(qP)和电子传递速率(ETR)等减轻干旱胁迫对小麦植株光系统Ⅱ的损伤，保证光合作用的顺利进行[8]。但外源H2S对萌发生长期黄瓜干旱胁迫缓解作用的研究迄今尚未见报道。

因此，本试验以黄瓜种子为材料，采用聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫，从生长指标、质膜透性和膜脂过氧化、渗透调节物质的质量分数及水解酶和抗氧化保护酶活性等角度，研究外源H2S对萌发生长期黄瓜干旱胁迫的缓解效果与作用机制，为H2S作为抗旱诱导剂在黄瓜生产上的推广应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料培养与处理

供试黄瓜品种‘新津研四号’由天津市中天种业有限公司提供。挑选籽粒饱满、大小均匀且无病虫伤害的黄瓜种子，用质量分数为0.1%氯化汞溶液消毒10 min，再用自来水和蒸馏水分别冲洗3次，晾干。将晾干后的黄瓜种子用蒸馏水或1 mmol·L-1NaHS溶液(H2S的供体)于25 ℃下浸种8 h，随后，将种子转入垫有3层滤纸的培养皿中，每皿20粒。分别向皿中加入蒸馏水或10% PEG6000溶液6 mL，然后将皿置于PYX-250S-A 型生化培养箱中，在25 ℃进行培养。每天定时向皿中补充0.5 mL(水分蒸发量)蒸馏水，以维持试验条件的恒定。试验共设4个处理，分别为①对照组(CK)：蒸馏水浸种，蒸馏水培养；②PEG：蒸馏水浸种，PEG6000培养；③NaHS：NaHS浸种，蒸馏水培养；④PEG+NaHS：NaHS浸种，PEG6000培养。每个处理重复3次，每个重复5皿，在处理的第2天统计发芽势，第3天统计发芽率，第4天进行生理和生化指标的测定，第6天测量胚轴长、根长及鲜质量。

1.2 试验方法

1.2.1 生长指标测定 以芽长≥1/2 种子长度作为发芽标准，按下式计算发芽势和发芽率：

发芽势=规定天数内发芽种子粒数/供试种子总粒数×100%

发芽率=全部发芽种子粒数/供试种子粒数×100%

每皿抽取10株，用直尺测量胚轴长和根长；用蒸馏水洗净并用滤纸吸干表面水分后，用万分之一天平称量鲜质量。

1.2.2 水解酶活性测定 淀粉酶活性的测定采用3，5 - 二硝基水杨酸比色法[9]；酯酶活性的测定采用固兰B盐显色法[10]。

1.2.3 抗氧化酶同工酶电泳 将1 g样品与3 mL提取液[0.05 mmol·L-1pH 7.8磷酸缓冲液，内含5 mmol·L-1β-巯基乙醇和质量分数为2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]混合于研钵中，再加少量石英砂，冰浴研磨至匀浆，4 ℃离心(10 000 ×g，30 min)，上清液为待测酶液。

抗氧化酶同工酶电泳参照王松华等[11]的方法。其中SOD(EC1.15.1.1) 同工酶电泳分离胶质量分数为10%，浓缩胶质量分数为5%，用氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为染色剂；过氧化物酶(POD；EC1.11.1.7)和CAT(EC1.11.1.6) 的同工酶电泳分离胶质量分数为7%，浓缩胶浓度为5%，其中POD同工酶电泳用醋酸联苯胺染色，CAT同工酶电泳用质量分数为2%铁氰化钾和2%氯化高铁染色。

1.2.4 根质膜透性测定 用伊文思蓝染色法测定根的质膜透性[12]。将根用0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液洗净，滤纸吸干，放入伊文思蓝染液(0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液，pH 5.6，含质量分数0.025%的伊文思蓝)中染色10 min，再用0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液漂洗至无蓝色析出，最后用滤纸吸干表面并拍照记录试验结果。

1.2.5 其他生理指标的测定 电解质渗漏率和丙二醛(MDA)质量摩尔浓度的测定参照Michael等[13]的方法；可溶性糖和游离脯氨酸(Pro)质量分数的测定分别采用蒽酮比色法和茚三酮显色法，具体参照李合生等[14]的方法。

1.3 数据统计分析

采用DPS 7.05软件中的Duncan’s新复极差法对试验数据进行差异显著性分析， 用OriginPro 9.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 H2S对黄瓜种子萌发生长的影响

发芽率、发芽势、根长、胚轴长和鲜质量等是反映植株生长状况的重要指标。由表1可以看出，PEG胁迫处理的发芽率、发芽势、根长、胚轴长和鲜质量等指标均显著低于CK(P<0.05)，表明干旱胁迫对黄瓜种子的萌发生长有显著的抑制作用；NaHS单独处理的发芽率和发芽势与CK相比差异并不显著，但其根长、胚轴长和鲜质量均显著优于CK(P<0.05)，说明NaHS处理对黄瓜种子的生长有一定的促进作用；与PEG胁迫处理相比，NaHS+PEG处理的各项指标均显著提高，说明外源H2S能显著缓解干旱胁迫对黄瓜种子萌发生长的抑制作用。

表1 H2S对干旱胁迫下黄瓜种子萌发生长的影响Table 1 Effects of H2S on germination and growth of cucumber seeds under drought stress

注:数据为3次测量的“平均值±标准差”。同列不同小写字母表示处理间差异达0.05显著水平。

Note:Data are “means ±standard deviation”(n = 3).Different lowercase letters in the same columns indicate significant difference among different treatments at 0.05 level.

2.2 H2S对质膜透性和膜脂过氧化的影响

干旱胁迫下，植物体内会产生大量的自由基，导致细胞膜系统严重损伤，膜脂过氧化产物MDA大量累积，同时，质膜通透性增大，电解质大量外渗。因此，可通过MDA质量摩尔浓度变化判断植株的膜脂过氧化水平；根据电解质渗漏率及根染色情况判定质膜的完整性。

从图1-A、B可以看出，与CK相比，PEG胁迫处理的电解质渗漏率和MDA质量摩尔浓度均显著上升，而NaHS处理则无明显变化；PEG+NaHS处理的电解质渗漏率和MDA质量摩尔浓度尽管较CK显著升高，但显著低于PEG胁迫处理。从图1-C可以看出，各处理的根经伊文思蓝染色后，均呈现明显的蓝色，其中PEG胁迫处理的根颜色较CK明显加深，NaHS处理的根颜色与CK相差不大，而PEG+NaHS处理的根颜色比CK略深，但明显浅于PEG胁迫处理。图1表明，H2S的供体NaHS对正常生长环境条件下黄瓜的质膜透性和膜脂过氧化无明显影响，但对干旱胁迫条件下黄瓜质膜透性的增大和膜脂过氧化水平的加重有显著的抑制作用。

2.3 H2S对渗透调节物质质量分数的影响

Pro和可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质，它们能维持细胞膨压，并有利于保持膜结构的完整[15]。由图2可知，与CK相比，其他各处理均能显著提高黄瓜种子的Pro和可溶性糖质量分数(P<0.05)，但以PEG+ NaHS处理的Pro和可溶性糖质量分数增加幅度最大，分别比CK提高43.78%和16.29%，表明外源H2S能够在黄瓜种子自身响应干旱胁迫的基础上进一步提高黄瓜种子中Pro和可溶性糖质量分数，以提升黄瓜种子对干旱胁迫的抗性。

2.4 H2S对水解酶活性的影响

淀粉酶和酯酶都是黄瓜种子萌发过程中不可或缺的重要酶类。他们能够为植物胚根和胚芽生长及器官建成提供物质基础和能量来源。从图3可以看出，淀粉酶和酯酶活性均以PEG+NaHS处理最高，其次为NaHS处理，再次为PEG胁迫处理，而CK处理的淀粉酶和酯酶活性均最低，各处理间2种酶活性的差异均达显著水平(P<0.05)，说明外源H2S能够显著增强黄瓜种子萌发期间淀粉酶和酯酶的活性，进而提高其对干旱胁迫的适应性。

A.电解质渗漏率Electrolyte leakage rate;B.MDA质量摩尔浓度MDA molality；C.根质膜透性Plasma membrane integrity of roots

图上不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同 Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level．The same below

图1外源H2S对黄瓜种子质膜透性和膜脂过氧化的影响
Fig.1EffectsofexogenousH2Sonplasmamembranepermeabilityandmembranelipidperoxidationduringgerminationandgrowthofcucumberseeds

2.5 H2S对抗氧化酶同工酶的影响

SOD、POD和CAT是细胞抵御活性氧伤害的重要保护酶系统，可以清除植物体内多余的活性氧，抑制膜脂过氧化作用。由图4-A可知，SOD同工酶有4条酶带，与CK相比，其他各处理的酶带均变宽，亮度增强，以PEG+NaHS处理最为明显；由图4-B可以看出，POD同工酶带为2条，与CK相比，其他各处理的POD酶带均变宽，颜色加深，仍以PEG +NaHS处理变化最为明显；图4-C的结果显示，CAT同工酶仅有1条酶带，与CK相比，其他各酶带的宽度及亮度变化趋势与SOD同工酶相同。图4结果表明，外源PEG处理或H2S处理均能促进黄瓜种子萌发期间SOD、POD和CAT同工酶的活性，但以PEG+NaHS处理的作用效果最为显著，说明外源H2S能够在黄瓜种子自身响应干旱胁迫的基础上进一步增强其抗氧化防御系统，以减缓干旱胁迫对其造成的损伤。

图2 渗透调节物质质量分数的变化Fig.2 Changes of substance mass fraction by osmotic adjustment

图3 水解酶活性的变化Fig.3 Changes of hydrolase activities

A.超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase；B.过氧化物酶 Peroxidase；C.过氧化氢酶 Catalase

3 讨 论

干旱是影响植物生长发育和形态建成的重要环境因素之一。在干旱胁迫条件下，植株的生长会明显受到抑制，同时体内会发生明显的生理和生化变化。一方面，植物细胞内的活性氧会迅速积累，导致膜脂过氧化损伤，细胞膜结构遭到破坏，质膜透性增强；另一方面，渗透调节物质的质量分数和保护酶的活性也会根据胁迫程度的不同发生相应变化[16-17]。本研究中，干旱胁迫显著抑制黄瓜种子的萌发，并导致质膜损伤和电解质外渗，MDA质量摩尔浓度也显著增加，类似的结果在胡萝卜[18]和水稻[19]中均有报道。此外，干旱胁迫也诱导黄瓜种子的适应性调节反应，表现为渗透调节物质质量分数增多，水解性和抗氧化酶活性增强，这与Zhang等[5]和Wegener等[20]的报道一致。

H2S作为一种非常重要的信号分子，在植物逆境胁迫下发挥重要作用，能够缓解植物体的逆境(干旱胁迫、盐胁迫、热激伤害和离子毒害等)伤害，提高植株对逆境的抗性[21]。本研究结果显示，PEG+NaHS处理组黄瓜种子的发芽势、发芽率、胚轴长、根长和鲜质量均显著超过PEG胁迫组，说明H2S 对干旱胁迫下黄瓜种子的萌发生长具有促进作用，这与刘晶等[22]的研究观点一致。

可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质的积累有利于维持干旱胁迫下植物细胞的渗透调节。吴单华等[23]研究证实，外源H2S 能提高干旱胁迫下小麦幼苗可溶性糖和脯氨酸的质量分数，维持干旱胁迫时的渗透水平。本研究中，PEG胁迫组的可溶性糖和脯氨酸质量分数均呈上升趋势，PEG+NaHS 处理进一步提升黄瓜种子的可溶性糖和脯氨酸的质量分数，使干旱胁迫条件下黄瓜种子的细胞膜系统稳定性得到维持，避免膜结构的破坏和细胞脱水，这是H2S增强黄瓜种子抗旱能力的首要因素。

种子在萌发期间需要许多营养物质和能量以维持其旺盛的生命活动[24]，这些养分和能量大多来自种子中淀粉、脂肪等贮藏物质的转化和利用，而此过程离不开淀粉酶、酯酶等水解酶的催化作用。Huang等[12]研究表明，外源H2S可使镉胁迫下小麦种子淀粉酶和酯酶活性显著增强；Zhang等[25-26]研究证实，H2S对小麦Cu2+和Al3+胁迫的缓解作用是由于H2S 提高了小麦淀粉酶同工酶和酯酶同工酶的活性。本试验结果表明，外源H2S能显著提高干旱胁迫条件下黄瓜种子淀粉酶和酯酶的活性，以促进贮藏物质的水解，满足黄瓜种子萌发及生长所需的重要营养物质，这是H2S提高黄瓜种子对干旱胁迫抗性的一个关键环节。

SOD、CAT和POD等是植物体内重要的抗氧化酶，它们协调作用，能有效清除植物体内的活性氧和过氧化物，缓解各种非生物胁迫对植物的损害[27]。Jin等[28]研究表明，外源H2S可刺激植物体内与干旱相关转录因子的表达，以调节活性氧代谢，并提高植株体内的抗氧化酶水平。本试验中，PEG胁迫组的SOD、CAT和POD水平均较CK明显升高，这是植物保护酶系统应激反应的表现；PEG+NaHS处理组的SOD、CAT和POD活性较PEG胁迫组进一步提高，并有效抑制了PEG胁迫下MDA质量摩尔浓度的增加及电解质渗漏率和质膜透性的增强，表明外源H2S能通过提高黄瓜种子的抗氧化酶水平，有效清除自由基，从而缓解了干旱胁迫导致的膜脂过氧化伤害，这是H2S提高黄瓜种子对干旱胁迫适应性的又一重要机制。

然而，植物细胞对干旱胁迫的响应是一个非常复杂的过程，可能会有其他信号物质的参与，也会涉及许多复杂的信号转导通路。外源H2S对黄瓜种子萌发期间干旱胁迫的缓解作用绝不仅限于上述机制，必然还包括基因表达及代谢调控等更为复杂的生理生化过程，这些都还有待于进一步深入研究。

4 结 论

干旱胁迫对黄瓜种子的萌发有明显的抑制作用，并导致膜质过氧化和质膜透性增加。外源H2S 可通过改善黄瓜种子的渗透调节能力，提高水解酶活性，提升SOD、CTA和POD抗氧化保护酶水平来增强其对干旱胁迫的适应性，促进干旱胁迫下黄瓜种子的萌发。